气-质联用法研究水溶性茯苓多糖提取方法

王 献,赵文杰,苏 波

(中南民族大学化学与材料科学学院,武汉430074)

茯苓(Po ria cocos)是一种药用真菌[1].茯苓多糖主要分水溶性茯苓多糖和碱溶性茯苓多糖,水溶性茯苓多糖是杂多糖,含量较低,临床证明是一种具有“扶正固体”、无任何毒副作用的抗肿瘤药物[2].热水浸提法和超声法是提取水溶性多糖应用较为广泛的方法[3-5],传统的测定方法为苯酚-浓硫酸法、蒽酮-浓硫酸法等[6-9].近几年来,随着多糖的分离分析和鉴定技术的发展,上述方法已由现代仪器分析技术,尤其色谱以及色谱-质谱联用技术所取代[10-13].一般化学法,手续繁杂,而且只能测定杂多糖的粗略总量[12],而GC-MS(气相色谱-质谱联用)法具有准确定性、分辨率高、灵敏度高等特点[14-15],大大提高了对多糖定量的可靠性.因此,本实验利用衍生化GCMS法和内标定量,优选热水浸提法和超声波法提取水溶性茯苓多糖的提取条件,研究了得到更高多糖得率及更加可靠的提取水溶性茯苓多糖的条件.

1 实验部分

1.1 仪器与试药

HP6890N-5973MSD气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司);HP-5MSAglient(0.25mm×30m×0.25μm)弹性石英熔融毛细管柱(美国安捷伦科技有限公司);调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂);智能集热式恒温加热磁力搅拌器(上海东玺制冷仪器设备有限公司);真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);超声波细胞粉碎机(宁波新芝科学仪器研究所).

果糖(对照品(≥ 99.5%)上海晶纯试剂有限公司),其它试剂均为分析纯.茯苓为湖北省罗田县规范化种植基地(GAP)的九资河茯苓(由湖北省中医药研究院药物研究所鉴定).

1.2 实验方法

1.2.1 GC-MS测定条件

载气:氦气;进样口温度:260℃;柱流速:1mL/min,进样量:1μL;分流比为20∶1;气化室温度:260℃;升温程序:起始温度为50℃,8℃/min升温至260℃;离子源:EI源;离子源温度:230℃;四极杆温度:150℃;气-质接口温度:280℃;电子能量:70eV.

1.2.2 样品预处理

将块状茯苓60℃下真空干燥,粉碎至60目,密封于密封袋中备用.

1.2.3 水溶性茯苓多糖热水浸提

水溶性茯苓多糖的提取步骤:茯苓粉末→浸泡过夜→加热回流→抽滤→浓缩→乙醇沉淀→依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→茯苓多糖粗品.

1.2.4 水溶性茯苓多糖的超声提取

水溶性茯苓多糖提取步骤:茯苓粉末→超声提取→抽滤→浓缩→乙醇沉淀→依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→茯苓多糖粗品.

1.2.5 茯苓多糖水解和衍生化方法

取5mg茯苓多糖粗品,加入5mL1mol/L H2SO4水解,适量BaSO4调至中性,取1mL水解后样品,加入100μL果糖(2mg/mL)做内标物,置于真空干燥箱中于65℃下烘干,冷却后分别加入50 μLBSTFA 和DMF各50μL,充氮密封,于75℃下水浴30min,待样品冷却后各加入500μL丙酮,离心取上清液待GC-MS分析.

1.2.6 标准单糖GC-MS定量分析和标准曲线制备

分别精密量取D-木糖醇/D-葡萄糖/D-甘露醇标准溶液(2mg/mL)10,20,30,40,50,100,150,200,250μL于干净干燥样品瓶中,再分别加入2mg/mL的果糖标准溶液100μL作内标物,按1.2.5中进行衍生化及GC-MS分析.以对照品单糖衍生物峰面积与内标衍生物峰面积之比为纵坐标Y,以对照品单糖衍生物质量浓度与内标衍生物质量浓度之比为横坐标X作图即为标准曲线.

2 结果与讨论

2.1 GC-MS定性分析

图1为热水浸提茯苓多糖的GC-MS总离子流图,图2为单糖的质谱图.

图1依出峰顺序各单糖组分分别为序号1～10.通过GC-MS仪的NSIT图谱库分析保留时间18.44min的峰(1),对应化合物名称为:D-1,2,3,4,5-五环-O-(三甲基硅烷基)-木糖醇,分子式C20H52O5Si5,其质谱图和结构式见图2.并且对照衍生化标准品D-木糖醇的GC-MS分析,获知其保留时间、质谱图与峰(1)一致,确认水溶性茯苓多糖中含有D-木糖醇.衍生化标准品D-果糖的GC-MSTIC谱图有3个色谱峰,保留时间分别为19.47,19.57,19.70min,与图1 中峰(3)、(4)、(5)一致,且其质谱图也完全相同,表明这3峰归属于所加入的内标物D-果糖的衍生物,即D-1,3,4,5,6,-五环-O-(三甲基硅烷基)-果糖,分子式为C21H52O6Si5,相同方法依次确认了保留时间为20.54min和21.63min的峰(8)和峰(10)为衍生化D-葡萄糖;保留时间为21.24 min的峰(9)的化合物为衍生化D-甘露醇.研究表明超声提取与热水提取茯苓多糖的GC-MS总离子流图的单糖出峰顺序和成份相当一致,只是糖类相对丰度略有不同.综上所述,水溶性茯苓多糖中所包含的单糖成分主要有D-木糖醇、D-甘露醇、D-葡萄糖.

热水浸提法为胞外提取法,超声提取法为胞内提取法,通过对两者的GC-MSTIC谱图分析,观察到热水浸提法谱图峰数较多较杂,峰形较宽,且衍生化葡萄糖、甘露醇、木糖醇的相对丰度要高于超声提取法.其主要差别可能来自于茯苓子实体结构较为致密,超声提取茯苓虽然经过较高功率的超声波破碎细胞壁进行的胞内提取[16]但总提取时间较短,而热水胞外提取通过浸泡和较长时间的加热回流有助于提取率的提高.

图1 热水浸提茯苓多糖的GC-M S总离子图Fig.1 To tal ion ch rom atography(T IC)spectrum o f po riacocospo lysacchar by ho tw ater ex traction

图2 D-1,2,3,4,5-五环-O-(三甲基硅烷基)-木糖醇的质谱图及化学结构式Fig.2 M ass spectrum o f 1,2,3,4,5-pen tak is-O-(trim ethy lsily l)-D-xy lito land its chem ical structure

2.2 正交实验分析

热水浸提茯苓多糖以蒸馏水为提取剂,固液比(1∶20,1∶30,1∶40)、提取时间(3,4,5 h)、提取温度(80,90,100℃)为影响茯苓多糖提取得率的主要因素,设计三因素三水平正交实验表进行正交实验.超声提取茯苓多糖以蒸馏水为提取剂,固液比(1∶10,1∶20,1∶30,1∶40),超声时间(15,30,45,60m in),超声功率(100,200,300,400W)主要影响因素,茯苓多糖提取得率(其单糖组分得率之和)为指标,设计三因素四水平正交实验表进行正交实验.根据极差分析(见表1)可知,影响热水浸提茯苓多糖得率的因素A＞B＞C,最佳条件为A 3B 1C2,即固液比1∶40,提取时间3 h,提取温度90℃;影响超声提取茯苓多糖的因素A＞C＞B,超声提取茯苓多糖的最佳条件为A 4C1B4,即固液比1∶40,超声功率为100W,提取时间60m in.

表1 极差分析Tab.1 Rang analysis tab le

2.3 茯苓中水溶性多糖含量的计算

在GC-M S优选的最佳提取条件下,平行提取多糖3次,根据内标标准曲线法确定组成茯苓中水溶性多糖的主要3种单糖含量,从而计算出水溶性茯苓多糖的提取率及精密度,如表2所示.

表2 各单糖及总多糖提取率Tab.2 M ono saccharide and the to tal ex traction rate o f po lysaccharides

3 结语

运用GC-M S法采用内标分析得出热水提取和超声提取水溶性茯苓多糖的平均提取率分别为13.0%和8.6%,所得提取率较高.2种提取方法相比较,超声波法操作简单,提取时间短,杂质干扰少,但是热水浸提法提取的茯苓多糖的得率高于超声波法.本文中的2种方法得到茯苓水溶性多糖提取率均高于现有文献报道值 2.4%[2]和0.239 7%[17].衍生化GC-M S法准确可靠,分辨率高,灵敏度高,适合于研究水溶性茯苓多糖的提取,也适用于其他糖类物质的研究.

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