壳聚糖在苦参醇提工艺中的应用

巩晓宇,陈科力

(1湖北中医学院省部共建中药资源和中药复方教育部重点实验室,武汉430065,Ch ina;2深圳市龙岗人民医院,深圳518172,Ch ina)

苦参为豆科植物苦参(Sophorae f lavescen tisA it)的干燥根,具有清热燥湿,杀虫利尿等作用,苦参所含有效成分主要为苦参碱和氧化苦参碱等易溶于水的生物碱类成分.关于苦参总碱的提取精制方法,有大量报道及文献比较了水提醇沉法、高速离心法和壳聚糖絮凝法对提取液中苦参总碱的精制过程[1-5],认为壳聚糖絮凝法是一种较好的精制方法.但是,还没有发现对壳聚糖精制苦参总碱的絮凝工艺条件进行优选的深入研究的报道.本文以苦参碱,氧化苦参碱含量为考察指标,对苦参醇提取液加入壳聚糖絮凝剂的最佳浓度、比例、静置时间进行选择.

1 材料和仪器

苦参为豆科植物苦参的干燥根,购于武昌区药材公司,经笔者鉴定.

戴安P680高效液相色谱仪,UVD 170UV检测器,四元梯度泵,HKZJZ-830171BA F戴安变色龙高效液相数据处理系统(美国戴安公司).

苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号:110805-200306);氧化苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号:0780-200004)絮凝专用壳聚糖(上海伟康生物制品有限公司).

甲醇为色谱纯(中国上海陆忠试剂厂);四氢呋喃(THF)为色谱纯(美国TED IA 公司);重蒸馏水为自制;其他试剂均为分析纯.

2 方法和结果

2.1 苦参醇提取液的制备

称取苦参药材200g,加入6倍量的60%乙醇,水浴回流提取3次,每次2 h,过滤,合并三次滤液,适当浓缩并定容至一定体积.

2.2 苦参碱、氧化苦参碱的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Inertsil C8-3(5.0μm,250mm×4.6 mm);柱温:25℃;流动相:甲醇:0.25%三乙胺的0.015m o l/L磷酸氢二钾溶液(用25%磷酸调节pH=3)(5:95);流速:1.0m L/m in;检测波长:220 nm.理论塔板数应当不低于5 000.

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取苦参碱对照品适量,加甲醇配制成浓度为52μg/m L的溶液;精密称取氧化苦参碱对照品适量,加甲醇配制成浓度为146μg/m L的溶液,即得.

2.2.3 供试品溶液的制备和测定

精密吸取制备和定容后的苦参醇提取液50 m L,减压浓缩至近干,转移至蒸发皿中,真空干燥至恒重,即得干浸膏.取干浸膏粉末约0.01 g,移至10 m L量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,过滤,取续滤液,即得.测定时,精密吸取供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪,即得.

2.2.4 标准曲线的绘制

(1)苦参碱标准曲线的绘制.分别制备不同浓度的苦参碱对照品溶液,精密吸取20μL注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定,以对照品进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,得回归方程为:Y=23.178X+0.039 8,r=0.999 8.结果表明,苦参碱进样量在0.208～1.04μg的范围内线性关系良好.

(2)氧化苦参碱标准曲线的制备.分别制备不同浓度的氧化苦参碱对照品溶液,精密吸取20μL注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定,以对照品进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,得回归方程为:Y=40.649X-0.184 8,r=0.999 7.结果表明,氧化苦参碱进样量在0.584～2.92μg的范围内线性关系良好.

2.2.5 加样回收率试验

(1)苦参碱加样回收率试验.精密称取6份已知苦参碱含量的苦参提取液的干浸膏粉约15m g于50m L量瓶中,分别精密加入适量苦参碱对照品,加甲醇至刻度,精密吸取供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪,按上法测定含量,计算回收率.加样回收率平均值为99.8%,RSD为0.90%.

(2)氧化苦参碱加样回收率试验.精密称取6份已知氧化苦参碱含量的苦参提取液的干浸膏粉约5m g于50m L量瓶中,分别精密加入适量氧化苦参碱对照品,加甲醇至刻度,精密吸取供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪,按上法测定含量,计算回收率.加样回收率平均值为101.2%,RSD为1.46%.

3 壳聚糖澄清工艺的考察

3.1 壳聚糖溶液的配制

分别取0.1 g,0.25 g,0.5 g,0.75 g,1.0 g壳聚糖粉末,加入50m L的1%的醋酸溶液放置溶胀24 h,再用1%的醋酸溶液定容为100m L,混匀,即得0.1%,0.25%,0.5%,0.75%,1.0%的壳聚糖醋酸溶液.

3.2 苦参药液浓缩比例的考察

制备3份苦参醇提取液,分别浓缩至药材-浓缩液为1∶4,1∶6和1∶8,放冷至室温,分别于搅拌下加入新鲜配制的0.25%的壳聚糖溶液,至溶液中有絮状沉淀产生,静置12 h,滤过.滤液按“2.1”项下方法测定苦参碱和苦参总碱含量.结果见表1.

表1 苦参药液浓缩比例的考察Tab.1 Inspecting o f p ropo rtion o f concen trated so lu tion vo lum e

结果浓缩比为1∶4时,经澄清后苦参碱的转移率很低;浓缩至1∶6和1∶8的壳聚糖澄清效果差别不大,但是1∶8的浓缩液耗用壳聚糖溶液的量较大,故选择药液浓缩比例为1∶6.

3.3 壳聚糖溶液浓度的考察

制备5份苦参醇提取液,分别浓缩至药材与浓缩液比为1∶6,分别于室温搅拌下加入配好的0.1%,0.25%,0.5%,0.75%,1.0%的壳聚糖溶液,至溶液中有絮状沉淀产生,静置24 h,滤过,观察澄清过程.过滤液按“2.1”项下方法测定苦参碱和苦参总碱含量.结果见表2.

表2 壳聚糖溶液浓度的考察Tab.2 Testof ch itosan concen tration

结果:壳聚糖的加入量,一般在0.1%～1%左右,据澄清后含量测定结果,选用0.75%的壳聚糖溶液进行澄清.

3.4 壳聚糖静置时间的考察

制备3份苦参醇提取液,分别浓缩至药材与浓缩液比为1∶6,于室温搅拌下加入配好的0.75%壳聚糖溶液,分别静置12h,18h,24h,滤过,观察澄清过程.过滤液按“2.1”项下方法测定苦参碱和苦参总碱含量.结果见表3.

表3 壳聚糖静置时间的考察Tab.3 Inspecting of tim e fo r ch itosan standing

结果表明,壳聚糖静置时间12 h,药液基本澄清,但含量较静置18 h,24 h的低,说明静置时间不足,而静置18 h的与静置24 h的样品含量无显著差别,所以选静置18 h.

4 结果与讨论

在以前的研究中,通过比较我们已经优选出苦参中苦参碱的最佳醇提取工艺为:加药材6倍量的60%乙醇,回流提取3次,每次2 h.因此本文苦参醇提物的制备也采用此方法.

优选壳聚糖澄清工艺为:浓缩至生药质量-浓缩液体积为1∶6,搅拌下加入0.75%的壳聚糖醋酸溶液,静置18 h,滤过.实验中还发现,壳聚糖醋酸溶液放置的时间越长,絮凝后的提取液中苦参总碱含量越低,所以澄清时应使用新鲜配制的壳聚糖溶液.

[1] 宋浩亮,罗华菲.壳聚糖对平胃胶囊中苦参碱含量影响的实验研究[J].西北药学杂志,2002,17(2):59-60.

[2] 张保献,冯青然.不同精制方法对苦参水提取液中苦参总生物碱含量的影响[J].中国中药杂志,2000,25(10):607-609.

[3] 陈科力,陈 刚.中药中的天然环氧化酶和酯氧化酶抑制剂及其作用.中南民族大学学报:自然科学版,2009,28(1):42-47.

[4] 张 形,徐莲英.壳聚糖用于部分单味中药浸提液澄清效果的研究[J].中草药,1999,30(10):745-747.

[5] 蒋珍藕.苦参碱的提取工艺及测定方法的研究进展[J].中医药导报,2005,11(8):90-94.