高效液相色谱法测定芬太尼的血药浓度

伦新强，梁健成(1.柳州医学高等专科学校第一附属医院，柳州 54500;.柳州市人民医院，柳州545006)

芬太尼为阿片受体激动剂，属于强效麻醉性镇痛药，其不良反应主要有呼吸抑制、肌肉强直、运动亢进和支气管痉挛等，有必要对血浆中芬太尼浓度进行动态监测。目前有用高效液相色谱法(HPLC)测定芬太尼血浆浓度的报告［1～3］，但仅限用于测定健康人的血浆浓度。本文建立了HPLC测定血浆中微量的芬太尼，并应用于监测临床分娩患者，适用于芬太尼血药浓度监测及药动学研究。

1 材料

高效液相色谱仪器(CTO-10ASVP，日本岛津):LC-10ATVP(A)及LC-10ATVP(B)恒流泵、SPD-10AVP紫外检测器、CTO-AS柱温箱、威玛色谱工作站;电子天平(BP211D型，北京赛多利斯仪器系统有限公司);漩涡振荡器(XW-80A型，上海医科大学仪器厂);离心机(LG16-W型，北京医用离心机厂)。枸橼酸芬太尼标准品(中国药品生物制品检定所);甲醇、乙睛为色谱纯;正己烷、氢氧化钠及其他试剂均为分析纯;纯化水。

2 方法与结果

2.1 芬太尼标准溶液的配制

精密称取枸橼酸芬太尼标准品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用纯化水溶解稀释至刻度，配制100 mg·L-1贮备液，依次稀释成 10、20、40、100、200、400 μg·L-1系列浓度标准液。

2.2 色谱条件

色谱柱为 Hypersil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)。流动相为溶剂 A(甲醇∶乙睛∶冰醋酸 =400∶200∶0.6)-溶剂 B［0.2%无水硫酸钠的醋酸铵溶液(1.5→100)］=68∶32，用三乙胺调pH为 6.5，流速为 1.0 mL·min-1。紫外检测波长为220 nm，柱温为室温，检测灵敏度为0.02 AUFS。

2.3 血浆样品的处理

精取血浆样品0.5 mL于10 mL具塞试管中，加入 NaOH溶液(2 mol·L-1)0.3 mL，涡旋混合 30 s，加入正己烷-乙醇(20∶1)4 mL，振荡震荡 5 min，离心 10 min(3 000 r·min-1)，取上层有机相于另一试管中。再加入正己烷-乙醇(20∶1)2 mL，振荡提取5 min，离心10 min(3 000 r·min-1)，取上层有机相，合并两次有机相提取液，于50℃水浴氮气吹干后，加入100 μL流动相溶解残渣，漩涡30 s，取20 μL进样分析。

2.4 系统适用性试验

色谱图见图1。在图中色谱条件下，芬太尼的保留时间为6.46 min，与内源性物质分离良好，以芬太尼计算理论塔板数不低于2 000。

图1 芬太尼高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of fentanyl

2.5 血浆芬太尼标准曲线的制备

取健康人的空白血浆0.5 mL，分别加入25 μL的10、20、40、100、200、400 μg·L-1系列浓度的芬太尼标准溶液，使其血浆浓度分别为0.476、0.952、1.905、4.762、9.524、19.048 μg·L-1按“2.2”项下血样处理方法操作，分别取 20 μL，在上述色谱条件下进样，以芬太尼峰面积(X)为横坐标，芬太尼血浆浓度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算，得回归方程为 Y=4.81×10-5X+8.99×10-2(r=0.999 9)，表明芬太尼在0.476～19.048 μg·L-1浓度范围内线性关系良好，最低检测限为 0.476 μg·L-1。

2.6 回收率与精密度试验

在空白血浆中加入芬太尼标准溶液，按“2.4”项下分别配制成 0.476、1.905、9.524 μg·L-1浓度，按血浆样品处理方法处理并测定，测得萃取回收率和方法回收率;同回收率测定方法，考察本法在不同浓度水平的精密度，结果见表1。

表1 含药血浆芬太尼回收率、精密度试验结果(n=5)Tab 1 Recovery rates and precision(RSDs)of fentanyl in drug-contained plasma(n=5)

2.7 样品测定结果

临床4例分娩患者按0.003 mg·kg-1体质量静脉注射芬太尼5 min后取血，按前述样品处理方法进样20 μL，测定患者血样中的血药浓度，结果分别为 0.602、3.782、0.681、2.779 μg·L-1，其血药浓度个体差异较大，限于检测数量较少，应进一步加强研究。

3 讨论

3.1 提取剂的选择

在提取剂的选择实验中曾试用三氯乙酸、硫酸铵、6%高氯酸、乙腈等提取溶剂，发现均存在不同的缺点。例如用三氯乙酸，存在的杂质峰有干扰;用乙腈提取，杂质干扰较多。经实验选择正己烷-乙醇(20∶1)为提取溶剂，不仅能提高萃取率，而且能最大限度地减少血浆中杂质的干扰及使芬太尼结构中氮充分转变为叔胺进入有机相［4］。

3.2 流动相的选择

分别采用参考文献所用的流动相，如用0.015 mol·L-1NaH2PO4的乙睛-水溶液(30∶70，V/V)为流动相［5］，保留时间过长，为22 min。另取纯化水(含0.005 mol·L-1辛烷磺酸钠，0.01 mol·L-1磷酸)-乙腈(69∶31)为流动相［6］，主峰与杂质峰有重叠。依据《中华人民共和国药典》，通过不断配比，最终确定流动性为溶剂A(甲醇∶乙腈∶冰醋酸 =400∶200∶0.6)-溶剂B［0.2% 无水硫酸钠的醋酸铵溶液)(1.5→100)］［7］=68∶32，并用三乙胺调节pH至6.5，在此条件下芬太尼的保留时间为6.84 min。因为有机相的比例大于60%，可以明显缩短分析时间，提高工作效率，且峰形较好，与相邻峰分离度大于1.5。与《中华人民共和国药典》不同之处在于，流动相中加入了三乙胺，其主要作为扫尾剂，改善峰形［8］。

本方法的回收率在96.32%以上，日内和日间差均小于2%，精密度较好，准确度较高，可用于临床芬太尼微量血药浓度的测定及药动学的研究。

［1］ 张燕婉，张 毅，胡小琴.反相离子对色谱法测定人血浆中芬太尼浓度［J］.中国药学杂志，1998，133(3):301.

［2］ 李正翔，赵 晴，董伟林.高效液相色谱法测定人血浆中芬太尼浓度［J］.中国医院药学杂志，2004，24(10):607.

［3］ 朱 珠，陈兰英.人血浆中芬太尼的高效液相色谱测定法［J］.中国医院药学杂志，1992，12(3):101.

［4］ 曹全胜，隋宁海，吕 航.高效液相色谱法测定枸橼酸芬太尼注射液［J］.中国医院药学杂志，1994，14(8):343.

［5］ 张 虹，方 昱，李 英.高效液相色谱法测定人血浆中芬太尼浓度［J］.同济大学学报，2005，1(26):49.

［6］ 林长赋，刘春婷，李文志，等.HLPC-紫外法测定人血浆中芬太尼浓度［J］.中国药房，2001，12(5):286.

［7］ 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(二部)［S］.2005年版.北京:化学工业出版社，2005:999.

［8］ 刘 浩，王红武，丁建英，等.流动相的离子强度对RP-HPLC中抗生素色谱峰的影响［J］.中国抗生素杂志，2007，1(32):25.