运用血清药理学方法探讨滋肾降糖丸对小鼠MSC成骨分化的影响及其机制

郭 彬，谢伟东，凌英蓉，肖永平，曾 斌，(.深圳市中医院药剂科，深圳 58020;2.清华大学深圳研究生院生命科学学部健康科学与技术重点实验室，深圳 58055)

骨质疏松是一种老年性常见病、多发病，全球现患病人数超过2亿人，然而目前仍缺乏有效的药物。中药在抗骨质疏松发挥了重要的作用［1］。滋肾降糖丸为临床应用多年的经典中药复方，主要成分为黄芪、党参、龟甲、三七、地黄、熟地、五味子、黄精、牛膝、牡蛎、骨碎粉等，主要功效为益气养阴、滋肾壮骨［2，3］，临床发现具有抗骨质疏松作用。由于滋肾降糖丸为中药复方制剂，缺乏有效的研究方法，物质基础和作用机制研究不是很清楚。中药复方血清药理学是一种有效的研究方法［4］。本研究通过该方法，利用骨髓基质干细胞的模型，探讨了滋肾降糖丸对成骨功能的影响及其相关机制，从而为临床相关用药奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

化学试剂:成骨诱导试剂地塞米松、2-磷酸抗坏血酸、2-磷酸甘油均购自sigma公司。血清及培养基购自美国Invitrogen公司。药物:滋肾降糖丸为深圳市中医院药剂科提供，批号为:100224。碱性磷酸酶购自南京建成生物工程研究所，批号为20100106。Trizol实际购自美国 Invitrogen公司。引物由Invitrogen公司合成。实时荧光定量 PCR(Q-RT-PCR)试剂盒购自TAKARA公司。细胞:NIH小鼠胫骨分离到的髓基质干细胞。动物:NIH小鼠，雄性，6周龄，购自广东省实验动物中心，动物合格证号(SCXK(粤)2008-0002)。

1.2 血清样品制备

选取深圳中医院药剂科制备的滋肾降糖丸，用蒸馏水研磨配制成混悬液，经临床剂量折算后，小鼠服用剂量为1.5 g·kg-1，经口给药，分别收集小鼠在服药后 0、0.5、1，2 及4 h后的含药血清，冻存于-20℃冰箱备用。

1.3 成骨诱导实验

取小鼠胫骨骨髓基质干细胞(MSC)，培养约3～5代左右，种植于24孔板中，培养基为 DMEM高糖 +10%FBS，具体培养方法按照以前发表的方法进行［5］。将不同时间段的含药血清按1%(v/v)添加到MSC培养孔中，同时添加成骨诱导试剂(10-8M 地塞米松，50 μg·mL-12-磷酸抗坏血酸、10 mM 2-磷酸甘油)，成骨诱导2周左右。每个样设置3个复孔，观察药物对成骨诱导及相关基因表达的影响。

1.4 茜素红(ARS)染色

成骨诱导2周后，用茜素红染色观察成骨现象。MSC用PBS洗2次后，用4%的多聚甲醛固定10 min。随后用去离子水洗2次，用2%ARS(pH 4.1)染色15 min，用去离子水洗2次，钙沉积物表现为桔红色。

1.5 碱性磷酸酶活性实验

成骨诱导第 6、9 d，用细胞裂解液(20 mM Tris-HCl(pH 7.5)，150 mM NaCl，1%Triton X-100)收集样品。细胞内碱性磷酸酶活性用试剂盒进行检测，总蛋白用Bradford的方法(Bio-Rad，USA)在酶标仪上于595 nm处进行测试，最后结果用总蛋白进行校正。

1.6 Q-RT-PCR

收集成骨诱导第3、6天的样品，调查其含药血清对 BMP2及RunX2这些基因表达的影响。总 RNA用Trizol试剂提取。用大连宝生物工程有限公司TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa Code:DRR081)试剂进行 Q-RT-PCR。检测在 7500 Real Time PCR系统 (Applied Biosystems，美国)。程序设置为95℃ × 30sec，接着95℃ ×5 sec，60℃ ×34sec进行40个循环，GAPDH作为内标。所有的样品测试3次。引物设计如下表1。

1.7 统计分析

数据表示为均数 ±标准差，组间采用单因素方差分析(ANOVA)，之后用 Newman-Keuls比较检测其显著性，P＜0.05视为具有统计学意义。

2 结果

2.1 含药血清对茜素红染色的影响

茜素红可以和成骨过程形成的钙结节染成橘红色，如未有成骨发生，则不显示橘红色的钙结节，并且成骨能力大小与染色深浅成正比，结果见图1。图1显示茜素红染色结果，与给药前0 h收集的血清比较，含药血清染色颜色显著增强，表明均有促进MSC成骨的作用，在时间点2 h收集的血清促进成果的作用最强，但在4 h时，促成骨作用有所减弱。表明再服用药物2 h内，血液中开始出现了促成骨分化的活性因子。

2.2 含药血清对碱性磷酸酶活性的影响

成骨过程中，细胞中碱性磷酸酶活性将显著增加，有利于成骨，因此检测其活性可以很好反应其成骨能力。将0 h血清设为对照，对照组活性设置为100%，其他时间点均与0 h时间点进行比较。结果表明，与0 h血清比较，含药血清在成骨诱导后第6和9天时均能显著增加碱性磷酸酶的活性，尤以2 h含药血清作用最强，4 h时有所回落，见图2。此结果与以上茜素红染色结果类似。图2中0 h，给药后0 h时收集的血清;0.5 h，给药后0.5 h时收集的血清;1 h，给药后1 h时收集的血清;2 h，给药后2 h时收集的血清;4 h，给药后4 h时收集的血清。数据表示为均数 ±标准差(n=3)，*P＜0.05，**P ＜0.01。

2.3 含药血清对BMP2及RunX2表达的影响

BMP2及RunX2是成骨分化过程的关键因子，其基因早期表达增高提示将促进成骨的发生。我们选取了在成骨诱导过程中较早的时间点第3 d和第6 d，经荧光定量PCR检测发现含药血清显著促进BMP2及RunX2基因的表达，以2 h作用效果最强，见图3。这表明含药血清成骨作用与促进这些基因的表达存在较好的关联。图3中0 h，给药后0 h时收集的血清;0.5 h，给药后0.5 h时收集的血清;1 h，给药后1 h时收集的血清;2 h，给药后2 h时收集的血清;4 h，给药后4 h时收集的血清。数据表示为均数 ±标准差(n=3)，*P＜0.05，**P ＜0.01。

图1 不同时间点含药血清对小鼠MSC成骨诱导的影响Fig 1 Effects of drug-containing serum sampled at different time points on osteogenesis differentiation of MSC

图2 不同时间点含药血清对成骨诱导第6和9天的MSC碱性磷酸酶活性的影响Fig 2 Effects of drug-containing serum sampled at different time points on the alkaline phosphatase activities at 3 and 6 days of induction of osteogenesis

3 讨论

骨质疏松的发病率很高，然而目前仍缺乏有效的药物。中药在预防和治疗骨质疏松等方面可能起了重要的作用。尽管如此，目前中药复方物质基础和作用机制研究较为困难。血清药理学是20世纪80年代日本学者田代真一提出的在动物给药后，一定时间内取血清研究药物药理活性的一种方法。后来国内外很多学者开始使用这一方法来研究中药复方的物质基础与作用机制。

滋肾降糖丸为深圳市中医院临床应用多年的中药复方制剂，临床研究发现，该药具有防治骨质疏松的作用，然而具体的机制不是很清楚。本研究首次通过血清药理学的方法，在动物服用滋肾降糖丸后，血液中可能含有有效成分，我们通过骨髓基质干细胞的成骨模型，观察到滋肾降糖丸具有明显的促成骨分化的作用(茜素红染色增强及碱性磷酸酶活性增加)。这提示滋肾降糖丸促骨髓基质干细胞的成骨分化可能是其抗骨质疏松的重要机制之一。

BMP2及RunX2是成骨分化过程的关键因子，BMP2诱导成骨能力较强，而RunX2则是成骨细胞分化和骨形成过程中的控制基因，它们在成骨过程中起了重要的作用［6］。通过 RTPCR实验研究发现，含药血清显著促进这些因子的表达。因此我们推测滋肾降糖丸通过上调BMP2及RunX2关键因子的基因表达，来促进 MSC的成骨分化，从而发挥抗骨质疏松的作用。

该研究为该中药复方的临床应用奠定了一定的理论基础，中药复方尽管复杂，但经过血清药理学、干细胞生物学等多种交叉学科的研究方法，我们发现滋肾降糖丸可能通过直接作用于MSC，发挥成骨效应，这为该类中药复方的机制研究提供了重要的参考。然而，血清中又是何种成分发挥这种促成骨的效应，我们并不是很清楚，这期待在将来的研究中用血清药物化学方法来加以解决。

图3 Q-RT-PCR检测不同时间点含药血清对成骨诱导第3 d和第6 d的MSC两个关键因子BMP2及RunX2基因表达的影响Fig 3 Effects of drug-containing serum sampled at different time points on gene expressions of BMP2 and RunX2 at 3 and 6 days of induction of osteogenesis detected by Q-RT-PCR assay

4 结论

滋肾降糖丸抗骨质疏松的作用可能与上调骨髓基质干细胞BMP2及RunX2的表达，从而促进其成骨分化有关。

［1］ 王 萍，王爱民，彭宣灏.中医药防治骨质疏松的研究概况［J］.时珍国医国药，2006，17(5):859.

［2］ 李惠林，黄皓月，张志玲，等.滋肾降糖丸治疗肾虚型2型糖尿病 30例疗效观察［J］.新中医，2006，38(2):50.

［3］ 吕 萍，龙新生，王菊萍，等.滋肾降糖丸质量标准的研究［J］.中国中医药科技，2004，11(6):362.

［4］ 杨彦芳，王玉芹.中药复方血清药理学方法规范化探讨［J］.中国中西医结合杂志，2000，20(5):380.

［5］ GaoL， CaiG， ShiX. Beta-ecdysterone induces osteogenic differentiation in mouse mesenchymal stem cells and relieves osteoporosis［J］.Biol Pharm Bull，2008，31(12):2245.

［6］ Phimphilai M，Zhao Z，Boules H，et al.BMP signaling is required for RUNX2-dependent induction of the osteoblast phenotype［J］.J Bone Miner Res，2006，21(4):637.