番泻总苷的纯化工艺研究

顾 燕， 薛 明， 刘 萌， 张思访， 严 军， 张朝波

(南京海陵中药制药工艺技术研究有限公司，江苏南京210049)

番泻叶为豆科植物狭叶番泻或尖叶番泻的干燥叶，味甘、苦，性寒，归大肠经，具泻热行滞、通便、利水之功效，用于热结积滞，便秘腹痛，水肿胀满［1］。据文献报道番泻苷A和番泻苷B为番泻叶泻下作用的主要有效成分，其泻下作用及刺激性较其他含蒽醌类的泻药更强，临床常用于急性便秘［2，3］。

本实验采用大孔树脂进行纯化工艺研究，以番泻苷A与番泻苷B的含量为指标，筛选最优的纯化条件。

1 试药与仪器

1.1 仪器

安捷伦1100型高效液相色谱仪，DAD检测器、BUCHI旋转蒸发仪、梅特勒电子分析天平。

1.2 试药与试剂

样品 番泻叶(江苏省药材公司)，番泻苷A对照品(批号:1126070 15204229含量≥97.0%)购自SIGMA公司，番泻苷B对照品(批号:1101562 10605370含量≥96.5%)购自SIGMA公司。

试剂 乙腈为色谱纯，三氟乙酸、草酸、碳酸氢钠均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 上样液的制备

取番泻叶药材，加沸水20倍量，80℃保温浸泡两次，每次45 min，合并滤液，并用草酸调节pH=3，离心，离心液作为上样液。

2.2 大孔吸附树脂的预处理

取DM301大孔吸附树脂，以95%乙醇湿法装柱，浸泡24 h，再用95%乙醇洗脱，再依次用2%的氢氧化钠溶液、纯化水、5%盐酸溶液浸泡冲洗，最后用纯水洗至中性，备用。

2.3 含量测定［4，5］

2.3.1 色谱条件

以八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈系统梯度洗脱;检测波长为340 nm;流速:1 mL/min;柱温:25℃。洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.3.2 样品及对照品的制备

对照品溶液的制备:精密称取番泻苷A对照品适量，以40%乙醇制成每1 mL含50 μg的对照品溶液;精密称取番泻苷B对照品适量，以30%乙醇制成每1 mL含70 μg的对照品溶液。

供试品溶液的制备:取番泻总苷提取物细粉0.025 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加入40%乙醇80 mL，超声处理(功率250 W，频率40 KHz，30℃)5 min，放冷，加40%乙醇至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即为供试品溶液。

2.3.3 样品的测定

分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.4 吸附树脂筛选研究

取番泻叶药材，按照2.1项进行上样液的准备。取预处理合格的DM-301型大孔树脂，分装两根柱(柱Ⅰ、柱Ⅱ)中，取上样液上柱Ⅰ，然后以7倍量柱体积水洗去杂，再以1 L 1 mol/L小苏打水溶液洗脱。自流出液颜色加深时开始接收，约接收1 L。用酸调节接收液至pH=3，上柱Ⅱ，然后以7倍量柱体积水洗去杂质，再以50%乙醇洗脱，自流出液颜色加深时开始接收。接受液蒸干，按照2.3项方法测定样品中番泻苷A、B的含量。同法对D-101、DA-201和DS-401型大孔吸附树脂分别进行考察。结果见表2。

表2 不同型号大孔吸附树脂对番泻总苷的纯化作用

结果表明DM-301型树脂的除杂效果好，所得提取物中番泻总苷的含量最高。所以我们选择DM-301型树脂。

2.5 DM-301型大孔树脂分离番泻总苷的工艺参数考察

2.5.1 树脂吸附量的考察

取预处理过的DM-301大孔吸附树脂共3份，分别装柱(柱 1，2，3)，备用。

取番泻叶600 g，按照2.1项进行上样液的准备。上样液分成3份，分别上柱，然后用410 mL(5倍柱床体积)水洗，合并流出液和水洗液，蒸干，按照2.3项方法测定样品中番泻苷A、B的含量。结果见表3。

表3 树脂吸附量测定结果

结论:树脂的平均吸附量为9.7 mg/g。以番泻叶药材中番泻苷A、B的平均含量1.48%计，番泻叶∶树脂=100∶183(g/g)。

2.5.2 吸附速度的考察

取番泻叶药材800 g药材，按照2.1项进行上样液的准备，均分成4 份，分别以8、12、16、20 mL/min 的速度上样，结果流出液中均未检出番泻苷A和B。因而选用20 mL/min的流速上样。

2.5.3 水洗速度及用量的确立

取番泻叶药材800 g药材，按照2.1项进行上样液的准备，均分成4 份，分别以8、12、16、20 mL/min 的速度水洗，按照柱体积分段接受。结果4种流速水洗液中均无番泻苷A、B，故选择20 mL/min作为水洗流速。当水洗至4 200 mL时，流出液的pH值接近中性，不显酸性。因此水洗量确定为4 200 mL，即7倍柱体积。

2.5.4 吸附pH的影响

对上样液的pH进行了考察，比较pH在3、4、5、6的情况下树脂柱的吸附能力。试验结果表明:pH值为3时DM-301大孔树脂对番泻苷A、B的吸附能力最强，上样及水洗流出液中均未检测到番泻苷A、B，因此我们确定上样液pH值为3。

2.5.5 NaHCO3的浓度和用量考察

由于番泻苷A、B中含有两个羧基(-COOH)，研究中发现，使用NaHCO3水溶液洗脱，再用水洗，能有效洗脱番泻苷A、B，而大多数杂质则保留在树脂柱上。

我们设计了不同浓度和用量的NaHCO3水溶液洗脱，结果每200 g药材以1 L 0.5 mol/L NaHCO3水溶液洗脱，再加纯水洗脱，弃去前1 400 mL，继续接收1 000 mL为最佳工艺。

2.5.6 二次上柱洗脱用乙醇的浓度考察

DM-301大孔树脂为非极性树脂，其洗脱方式应用极性从大到小的溶剂洗脱，考察不同浓度的乙醇对番泻苷的洗脱情况。

称取4份番泻叶，每份200 g，按照上述条件处理后2次上柱，设计不同浓度的乙醇进行洗脱，洗脱液蒸干后按照2.3项法测定。结果见表4。

表4 不同乙醇洗脱的结果

从表中看出，20%的乙醇无法将番泻苷洗出，30%和40%的乙醇只能洗出一部分番泻苷，50%和60%的乙醇能将大部分番泻苷洗脱出来，但从测定的图谱看，60%乙醇洗脱物中含有较多的杂质，因而我们选择50%的乙醇作为洗脱液。

2.6 番泻总苷最终的纯化工艺

取番泻叶，加沸水20倍量，80℃保温浸泡两次，每次45 min，滤液冷却至室温，调pH至3，离心。离心液上DM-301树脂柱，纯水洗至molish反应呈阴性。以0.5 mol/L NaHCO3水溶液洗脱，然后以纯水洗脱。自色带即将流出时开始接收，盐酸中和接收液，上另一DM-301树脂柱，水洗，50%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩成流浸膏，60℃减压干燥，粉碎得棕褐色粉末，即得。

3 讨论

本实验利用酸调节pH值以释放番泻苷中的-COOH基团，从而增加其在非极性大孔树脂柱上的吸附性能，然后用NaHCO3洗脱，又将-COOH基团转化成-COO-有利于水的洗脱，使得番泻苷与弱极性杂质分离，其洗脱液再调至酸性，以增加番泻苷的极性，二次上柱，用50%乙醇洗脱纯化，以使番泻总苷的含量达到50%以上，满足药用要求。

［1］中国药典［S］.一部.2005:242.

［2］邓远辉，冯 怡，黄家辉.番泻叶提取工艺研究［J］.中国实验方剂学杂志，2004，10(1):20-21.

［3］张亚东.乙醇提取番泻叶中总番泻苷的工艺优选［J］.江苏药学与临床研究，2002，10(3):20-21.

［4］曹 蔚，李教社，靖 会，等.反相高效液相色谱法测定番泻叶中番泻苷A含量［J］.中国中药杂志，2003，28(1):84.

［5］吕曙华，吕归宝.HPLC法测定番泻叶中番泻苷A及番泻苷B的含量［J］.中国药品标准，2002，3(5):48.