女金丸薄层色谱鉴别方法研究

戴 敬， 杨晓婧， 郝培培， 冯 丽， 李建晨

(1.河北省药品检验所，河北石家庄050011;2.河北科技大学，河北石家庄050018)

女金丸系由当归、白芍、肉桂、益母草、牡丹皮、延胡索、黄芩、陈皮等二十三味中药制成的大蜜丸或水蜜丸，具益气养血，理气活血，止痛之功效，用于气血两虚、气滞血瘀所致的月经不调［1］340。女金丸现行质量标准收载于《中国药典》2005年版一部，标准中仅有丹皮酚、桂皮醛和黄芩苷3项薄层色谱鉴别，并且鉴别方法尚不完善，如丹皮酚的鉴别前处理方法较难操作;桂皮醛的鉴别采用的展开剂含因毒性较大而被禁用的溶剂苯，黄芩苷的鉴别重现性较差等问题，因此我们对女金丸的薄层鉴别方法进行了研究，不仅对现有鉴别进行了改进和完善，还研究建立了白芍、益母草、延胡索、陈皮的薄层色谱鉴别方法。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

瑞士CAMAG REPROSTAR 3薄层色谱数码相机成像系统。

1.2 对照品、对照药材

均由中国药品生物制品检定所提供:丹皮酚(批号:0708-9704)，桂皮醛(批号:111710-200513)，黄芩苷(批号:110715-200514)，芍药苷(批号:0736-200219)，盐酸水苏碱(批号:110712-200508);延胡索(批号:120928-200604)，黄芩(批号:120955-200406)，陈皮(批号:120969-200406)。

1.3 女金丸样品

大蜜丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂(批号:4013142、7013422、6013332)、哈药集团世一堂制药厂(批号:0708141、0709104)、河北世济唐威药业有限公司(批号:20070526)、包头中药有限责任公司(批号:071113)、亚宝药业大同制药有限公司(批号:20070123)提供;水蜜丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂(批号:8035235 25)、黑龙江葵花药业股份有限公司(批号:20071103、20071104、20071105)、吉林双士药业有限责任公司(批号:081001、081101、081102)、西安自力药业有限责任公司(批号:20060701、20060702)提供。各阴性对照样品根据处方及制法自制。

1.4 试剂

大孔吸附树脂60～16目，D-101净品型，天津市海光化工有限公司生产;聚酰胺100～200目、聚酰胺薄膜均由浙江省台州市陆桥四甲生化塑料厂生产;中性氧化铝100～200目上海五四化学试剂有限公司生产;活性炭天津市红岩化学试剂厂生产;732阳离子交换树脂国药集团化学试剂有限公司生产;其他试剂均为分析纯。

1.5 硅胶G预制薄层板

青岛海洋化工厂分厂生产。

2 方法与结果

2.1丹皮酚的TLC鉴别

取本品水蜜丸10 g，研碎;或取大蜜丸18 g，剪碎。置500 mL圆底烧瓶中，加水200 mL，连接挥发油测定器，自测定器上端加水至刻度并溢流入烧瓶时为止，再加入石油醚(60～90℃)1 mL，连接回流冷凝器，加热并保持微沸1 h，放冷，取石油醚层作为供试品溶液。另取丹皮酚对照品，加石油醚(60～90℃)制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液-盐酸(50∶1)。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。牡丹皮与白芍阴性对照无干扰，方法具专属性(见图1)。

图1 丹皮酚TLC鉴别照片

2.2 桂皮醛的TLC鉴别

取2.1项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加石油醚(60～90℃)制成每1 mL含0.5 μL的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液5 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(17 ∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，放置至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。肉桂阴性对照无干扰，方法具专属性(见图2)。

图2 桂皮醛TLC鉴别照片

2.3 延胡索的TLC鉴别

取本品水蜜丸10 g，研碎，加氨水5 mL;或取大蜜丸18 g，剪碎，加硅藻土10 g，研匀，加浓氨溶液10 mL，密塞，振摇，放置10 min，加三氯甲烷60 mL，加热回流30 min，滤过，滤液浓缩至约10 mL，移置分液漏斗中，用0.5 mol/L的盐酸溶液振摇提取2次，每次10 mL，合并酸溶液，加浓氨溶液5 mL(使pH值11以上)，用三氯甲烷振摇提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，残渣加三氯甲烷溶解使成0.5 mL，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材0.5 g，加浓氨溶液0.5 mL，振摇，放置10 min，加三氯甲烷20 mL，同法制成对照药材溶液。吸取供试品溶液10～20 μL、对照药材溶液10 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。延胡索阴性对照无干扰，方法具专属性(见图3)。

图3-A 延胡索TLC鉴别照片

2.4 黄芩TLC鉴别

图3-B 延胡索TLC鉴别照片

取本品水蜜丸5 g，研碎;或取大蜜丸9 g，剪碎，加硅藻土5 g，研匀，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，用脱脂棉滤过，滤液加于D101型大孔吸附树脂柱(16～60目，内径为1.5 cm，柱高为15 cm)上，流速为1.0～1.5 mL/min，依次以水、30%乙醇各50 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50%乙醇5 mL溶解，加于聚酰胺柱(100～200目，1 g，内径为1 cm，用水湿法装柱)上，用50%乙醇10 mL洗脱，收集流出液及洗脱液，备用，继用乙醇10 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芩对照药材0.1 g，加甲醇5 mL，超声处理10 min，摇匀，静置，取上清液作为对照药材溶液。再取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述3种溶液各4 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以36%醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。黄芩阴性对照无干扰，方法具专属性(见图4)。

图4-A 黄芩TLC鉴别照片

图4-B 黄芩TLC鉴别照片

2.5 陈皮的TLC鉴别

取2.4项下备用的聚酰胺柱50%乙醇洗脱液，在水浴上蒸除乙醇，加水至约5 mL，移置分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次5 mL，合并乙酸乙酯液(水溶液备用)，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取陈皮对照药材0.1 g，加甲醇5 mL，超声处理10 min，摇匀，静置，取上清液作为对照药材溶液。吸取上述两种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(28∶10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热5 min，放冷，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。陈皮阴性对照无干扰，方法具专属性(见图5)。

图5-A 陈皮TLC鉴别照片

图5-B 陈皮TLC鉴别照片

2.6 芍药苷的TLC鉴别

取2.5项下乙酸乙酯提取后的水溶液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次8 mL，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇5 mL分次溶解，加于中性氧化铝柱(100～200目，2 g，内径为1 cm，干法装柱)上，用80%甲醇20 mL洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶18 ∶10)10℃以下放置12 h的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。白芍与牡丹皮阴性对照无干扰，方法具专属性(见图6)。

图6-A 芍药苷TLC鉴别照片

图7-A 益母草TLC鉴别照片

图6-B 芍药苷TLC鉴别照片

图7-B 益母草TLC鉴别照片

2.7 盐酸水苏碱TLC鉴别

取本品水蜜丸5 g，研碎;或取大蜜丸9 g，剪碎，加水60 mL，搅拌使溶散，微沸回流30 min，放冷，离心，取上清液，加稀盐酸调pH至1～2，离心，取上清液，滤过，滤液通过已处理好的732阳离子交换树脂柱(粒度为0.3～1.2 mm，内径为10 mm，柱高为15 cm)，流速为1.0～1.5 mL/min，以水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液，再以氨水溶液(15→100)30 mL洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加80%乙醇10 mL分次溶解，加于活性炭-中性氧化铝柱(活性炭100目以上，0.3 g;中性氧化铝100～200目，2 g;混匀，装柱，内径为15 mm)上，用80%乙醇20 mL洗脱，收集流出液与洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯(8 ∶3 ∶1)为展开剂，展开，取出，晾干12 h以上，喷以稀碘化铋钾试液，放置2～3 h，在日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。益母草阴性对照无干扰，方法具专属性(见图7)。

3 讨论

3.1 本实验建立了处方药味牡丹皮与白芍所含丹皮酚的TLC鉴别方法。该方法供试品溶液制备采用挥发油提取法，避免了硅藻土研磨操作和大量有机溶剂的使用，达到简化操作，环保的目的。采用氢氧化钠改性硅胶G板进行薄层层析，可以充分消除杂质的干扰。

3.2 由于桂皮醛与丹皮酚的理化性质相似，故桂皮醛的鉴别采用与丹皮酚鉴别相同的供试品溶液。2005版中国药典采用的展开剂含有因毒性较大目前被禁用的溶剂苯，所以我们经实验改变了展开剂的种类和配比，使用毒性较小的溶剂替代了苯。显色时，斑点随放置时间延长而加深，以放置0.5～1 h后观察为宜。

3.3 延胡索的主要成分是生物碱类使用氢氧化钠改性的硅胶G板进行薄层层析，可有效改善斑点拖尾现象，展开后的薄层板喷显色剂后，可覆盖同样大小的玻璃片放置一定时间，板面背景颜色会逐渐变浅，会利于观察斑点显色情况。

3.4 大孔吸附树脂柱洗脱溶剂考察结果表明水和30%乙醇洗脱液中不含黄芩苷，50%乙醇和70%乙醇洗脱液中均含有黄芩苷，故以70%乙醇洗脱。聚酰胺柱洗脱溶剂考察结果表明50%乙醇洗脱液不含黄芩苷，70%乙醇和乙醇洗脱液中均含黄芩苷，故以乙醇洗脱。曾试用展开剂乙酸乙酯-甲酸(6∶1)，虽然色谱斑点较圆整，但由于阴性有干扰而无法采用，故选用36%醋酸为展开剂。采用黄芩苷对照品与黄芩对照药材同时作对照，可以获得较多的鉴别信息。

3.5 陈皮的供试品溶液制备采用聚酰胺柱50%乙醇洗脱部分，再经乙酸乙酯萃取制得。由于橙皮苷对照品较难溶解，故以陈皮对照药材作对照，对照药材制备方法也较简便，薄层色谱结果令人满意。

3.6 芍药苷供试品溶液采用鉴别陈皮时用乙酸乙酯提取后剩下的水溶液经正丁醇萃取制得，可以减少检验样品用量并简化操作。使用硅胶G薄层板进行薄层层析，结果空白对照色谱中在与对照品色谱相应的位置上显同样的淡红色斑点，阴性有干扰。改用氢氧化钠改性的硅胶G薄层板进行薄层层析，可以充分消除阴性的干扰，提高了方法的专属性。曾试用展开剂三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40 ∶5 ∶10

∶0.2)和三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10)10℃以下放置12 h的下层溶液为展开剂，因色谱结果均不理想而未予采用。

3.7 益母草供试品溶液的制备采用了732强酸性阳离子交换树脂选择性吸附生物碱，达到与糖、蜜等水溶性成分分离目的。再经活性炭-中性氧化铝柱进一步净化除杂，供试液点样容易，色谱结果无背景，斑点清晰。曾试用展开剂醋酸乙酯-无水乙醇-甲酸(3 ∶2 ∶2)、丙酮-无水乙醇-盐酸(10∶6∶1)，因色谱结果均不理想而未予采用。喷显色剂后开始斑点较淡，放置约2～3 h更容易观察。

［1］中国药典［S］.一部.2005.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典中药材薄层色谱彩色图集(第一册)［M］.北京:人民卫生出版社，2009:262.