血清脂蛋白a和载脂蛋白a(TTTTA)(n)基因多态性与血管性认知功能障碍的关系*

于爱玲 赵仁亮 王 勤 秦丽晨

(1青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003；2 泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

血管性认知功能障碍 (vascular cognitive impairment, VCI)是血管或与血管相关因素引起的认知功能障碍，它可以单独发生或与Alzheimer病合并出现[1]。VCI范围包括非痴呆血管性认知功能障碍、血管性痴呆、伴有血管因素的阿尔茨海默病((AD)三大类，均与动脉粥样硬化有关[2]。Apo(a)是脂蛋白(a)[]的独特抗原成分，是一种高度糖基化的蛋白质，具有促进动脉粥样硬化斑块形成的作用，近年来成为遗传学和生物化学的研究热点之一[3]。在Apo(a)5’端侧翼1.5 kb内存在一个5核苷酸的重复序列(TTTTA)n(pentanucleotide repeats，PNR)显示多态性，对研究遗传和预测动脉粥样硬化的危险性具有一定的价值[4]。血清Lp(a)与心脑血管病密切相关，而其与血管性认知功能障碍的关系尚不清楚。为此我们检测了2008年1月至2009年8月在我院诊治122例VCI患者血清LP(a)浓度及Apo(a)基因的5’调控区(TTTTA)n基因的多态性，并与88例健康查体者对照，探讨Apoa (TTTTA)n基因多态性在血管性认知功能障碍患者中的分布状况及其与血清Lp(a)水平的关系，为VCI的早期治疗及进行一级和二级预防提供依据。

1 对象与方法

1.1对象 病例组为2008年1月至2009年8月在我院诊治的血管性认知功能障碍患者122例，男78例，女44例，平均年龄65岁。均按蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment, MoCA)加简易精神状态检查量表(MMSE)选取，同时排除以下原因导致的认知障碍，如中枢神经系统创伤、感染、代谢性疾病、正常压力脑积水、叶酸或者维生素B12缺乏、甲状腺功能低下、癫痫、肿瘤、多发性硬化、精神病、酗酒或滥用药物等，另排除汉密尔顿抑郁量表(Hamilton Depression, HAMD)<8分，汉密尔顿焦虑量表(HAMA) <7分患者。对照组88例，男51例，女37例，平均年龄60岁，均为同地区同期同年龄组同种族健康老年人。病例组与对照组性别构成比及受教育程度无显著性差异，且两组均排除肝、肾、内分泌等影响脂质代谢的疾病。

1.2血清Lp(a)测定 用免疫放射比浊法,在全自动生化仪上进行检测。以300 mg/l为界。

1.3基因组DNA提取和Apo(a)PNR基因型测定 100 μl全血采用碘化钠法提取基因组DNA。用一对寡核苷酸引物扩增Apo(a)PNR基因序列，引物序列为P1:5’-GAATTCATITrGcGGAAAGATrG-3’；P2：5’-CTTCAACCCGGGTGAGAGTCTC-3’，反应体系及反应条件参照Malgaretti等[5]的方法。取PCR产物1.5 μl，加样于2.5%的琼脂糖凝胶上电泳，100 V、60mA、电泳30 min，在紫外灯箱里观察电泳条带，然后取电泳条带较亮的PCR产物2.0μl予6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，400 V、7mA预电泳20 min，然后1000 V、12 mA电泳2 h结束。最后用银染法染色，并观测结果。

1.4统计学分析 计量资料数据以均数±标准差表示，采用方差分析，组间比较用q检验。计数资料采用χ2检验。全部数据采用Excel 2003软件处理。

2 结 果

2.1基因型检测结果 采用PCR技术扩增出含五核苷酸重复序列的Apo(a)基因片段，经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，共检出8种五核苷酸重复序列等位基因，16种五核苷酸重复序列基因型，分别为4/4、4/9、5/5、5/6、5/7、5/8、5/9、5/11、7/8 、7/9、8/9、8/10 、8/11 、9/9、10/10、和10/11。DNA片段长度76～1 l 1bp。常见基因型电泳结果见图1。

图1 PCR扩增Apo(a)(TTTTA)n基因型，6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染色图谱。两侧为Marker,其中分别为1：4/9，2：7/8，3：7/9，4：5/8，5：8/8，6：8/9，7：9/9，8：8/11

2.2病例组与对照组中主要基因型频率分布情况(表1)。两组人群Apo(a)PNR共检出16种基因型和7种等位基因，两组人群基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。两组人群男、女间基因型分布没有显著差异，但两组人群间Apo(a)PNR基因型有显著差异。两组中纯合子8/8基因型携带者占整个人群的50%左右，血管性认知功能障碍组中5/8基因型分布频率高于对照组，基因频率分布差别有统计学意义(χ2=14．59，P<0.05)。

表1 血管性认知功能障碍组和对照组中主要基因型频率

2.3高Lp(a)组及低Lp(a)组中基因型分布见表2。高Lp(a)组5/8基因型携带者明显高于低Lp(a)组(P<0．01)。

表2 高Lp(a)组和低Lp(a)组主要基因型的分布频数

2.4高Lp(a)组和低Lp(a)组中血管性认知功能障碍的发病情况： 高Lp(a)组中血管性认知功能障碍患者人数为38，发病比例为0.76，而低Lp(a)组中血管性认知功能障碍患者共84人，发病比例为0.53。血管性认知功能障碍病人在两组中的分布亦有统计学意义(χ2=9．57，P<0.01)。

2.5基因型与血清Lp(a)水平的关系 对照组中5/8基因型Lp(a)水平虽然高于其他几种基因型，但只有5/8型基因型与8/9基因型相比差别有统计学意义(P<0.05)，而与其他基因型间的Lp(a)比较差别无统计学意义。在血管性认知功能障碍组中，5/8基因型携带者的Lp(a)水平均高于其他几种主要基因型携带者，并有统计学意义，见表3

表3 基因型与VCI组和对照组Lp(a)水平的关系

注：a=2.36，为对照组4种基因型组间比较；b=2.89，为VCI组4种基因型组间比较；c=3.37，为VCI组5/8与8/8均数两两比较；d=4.61，为对照组5/8与8/9均数两两比较；e=4.21，为VCI组5/8与8/9均数两两比较；f=VCI组5/8与9/9均数两两比较；以上P<0.05。

3 讨 论

近年来，国际上提出了血管性认知功能损害(vascular cognitive impairement, VCI)的概念,呼吁积极识别和控制引起各种认知损害的血管性危险因素。我国亦根据国情在2007年编篡了《血管性认知功能损害专家共识》。此共识再一次从血管角度要求临床医师重视VCI的病因之一动脉粥样硬化的早期控制。

许多学者认为LP(a)参与并加速动脉硬化的形成和发展，是心脑血管疾病的危险因素[6,7]。LP(a)的高血清浓度与冠心病、脑血管病、糖尿病等多种疾病有密切的相关性。刘晓宁等[8]的研究证实脑梗死组中LP(a)较对照组高，且Apo(a)n的小片断重复与脑梗死的发病有关。侯泽等[9]报道糖尿病血管并发症如视网膜病变，肾病变组血清LP(a)水平升高。本研究结果亦显示高血清LP(a)组中血管性认知功能障碍发病率高。提示高血清LP(a)者需引起人群注意。有研究认为LP(a)无法用药物来调控，故对高血清LP(a)人群，需及早加强其它诱发动脉粥样硬化可控高危因素如吸烟，饮酒，肥胖等的控制。

LP(a)是一种与低密度脂蛋白(LDL)类似的脂蛋白，由LDL成分和Apo(a)组成。LP(a)的血清浓度与Apo(a)分子量大小成反比，主要由Apo(a)基因的多态性决定，有个体差异和种族差异。其中导致Apo(a)基因多态性的位点有一个是由位于Apo(a)基因1373bp处起始密码子前5个核苷酸序列(TTTTA)n的重复数目决定[10]。本研究检测200名中国泰安地区汉族人，共检出8种等位基因，16种基因型。这与中国湖北地区汉族人群载脂蛋白(a)(TTTTA)n检出结果略有不同[11]。但本研究检出的常见等位基因型与胡波报道相似,主要为5/8、8/8、8/9、9/9型。在血管性认知功能障碍组中5/8基因型频率高于对照组，具有统计学意义。在血管性认知功能障碍组中，5/8基因型携带者的Lp(a)水平均高于其他几种主要基因型携带者，也具有统计学意义。而在对照组中高LP (a)组的Apo(a)(TTTTA)n基因型以5/8型多见，但除5/8型基因型与8/9基因型相比差别有统计学意义，其余各型差别无统计学意义。此研究结果提示Apo(a)(TTTTA)n基因型差异与血管性认知功能障碍有一定相关性。Apo(a)重复序列数为5的等位基因可能是我国泰安地区汉族人群血管性认知功能障碍病人的一个危险因素之一，在血管性认知功能障碍的防治工作中应予以重视。

目前对不同种族的研究结果显示，至今已发现8种等位基因，其中重复序列数为6的等位基因多见于黑种人，而重复序列数为4、5的等位基因多见于黄种人，欧美白种人中未见重复序列数为4、5、6的等位基因出现[12]。本实验检出的基因型与国内外报道的不甚相同，提示存在种族和地区差异。Apo(a)(TTTTA)n基因多态性及它的地区和种族差异为血管性认知功能障碍的基因研究和防治提供了重要参考依据。但本研究亦有局限之处。因为VCI是一综合征，是一笼统的概念，没有唯一的诊断标准，不同的诊断标准VCI的患病率和发病率不同[1，13]。而且本研究中病例组入选患者中以脑血管因素致VCI者为多，脑血管外因素致VCI者少些。故血清LPa和Apo(a)(TTTTA)(n)基因多态性与血管性认知功能障碍的关系尚可通过不同VCI诊断标准等来做进一步的研究。

[1] 血管性认知功能损害专家共识组.血管性认知功能损害的专家共识[J]. 中华内科杂志，2007，12：1052-1055.

[2] Sullivaa MG, Statham PF, Jones PA. Role of intracranial pressure monitoring in severely head injured patients without sins of intracranial hypertension on initial computerized tomograpy [J]. J Neurosurg, 1994, 80(1): 46-50.

[3] 何春燕，洪嘉玲．Apo(a)基因和血浆Lp(a)浓度[J]．国外医学临床生物学与检验分册,1998,19：9-12．

[4] 王雪,刘昱,马爱群.载脂蛋白基因多态性与脑卒中危险因素[J].卒中与神经疾病,2004，11 (1):61-63.

[5] Malgaretti N，Acquati F, Magnaghi P，et al. charalterization by yeast artificial chromosme cloning of the linked apolipoprotein(a)and plasminogen genes and identification of the apolipoprotein(a) 5'flanking region[J]．proc Natl Acad Sc i USA．1992,89：11584-11588．

[6] Eckardstein AV，Schulte H，Cullen P，et al. Lipoprotein(a)furtherincreases the risk of coronary events in men with high global cardiovascular risk[J]. J Am Coll Cardiol，2001，37：434-439.

[7] Shintani S，Kikuchi S，Hamaguchi H，et al. High serum lipoptotein(a)levels are an independent risk factor for cerebral infarction[J]. Stroke，1993，24：965-969.

[8] 刘晓宁，孙莉，李昭晖,等.心肌梗死和脑梗死病人载脂蛋白a五核苷酸重复序列基因多态性及与血浆脂蛋白(a)水平的关系[J].中华医学杂志，2002，20：1396-1400.

[9] 侯泽，沃兴德，刘德文.2型糖尿病血管并发症患者血清脂蛋白(a)水平与载脂蛋白(a)基因多态性分析[J]．中国药物与临床, 2007，4：275-277.

[10] 胡波，周新，邵华. 载脂蛋白(a)五核苷酸串联重复序列基因型的检测.中华检验医学杂志，2000，2：83-86.

[11] 胡波，周新，李林,等．冠状动脉粥样硬化性心脏病患者载脂蛋白(a)五核苷酸重复序列基因多态性的初步研究[J]．中华医学遗传学杂志，2002，19：46-48.

[12] Ochl S．ingenhel A．A pentanncleotide repeat polymorphism in the control region of the apolipoprotein(a)gene is associated with lipoprotein(a)plasma concentrations in Caucasians[J]．J Clin Invest,1995，19：251-253．

[13] Chui HC,Nielsen-Brown N .Vascular cognitive impairment[J]. Continuum Lifelong Learning Neural,2007，13：109-143.