桑黄粗多糖对小鼠免疫功能影响的研究*

金培勇 靳凤琳 张海燕

(泰山医学院附属医院，山东 泰安 271000)

多糖是由酮糖或醛糖通过苷键连接在一起的多聚物，是一类天然生物大分子物质，广泛存在于植物、动物、微生物细胞内。多糖具有肯定的抗肿瘤、激活免疫细胞、调节机体免疫功能的作用，目前已发现的具有广泛生物活性的多糖主要是植物、真菌多糖。桑黄是泰山资源丰富的真菌资源，作为食用兼药用真菌，明清泰山古籍均曾记载具“驱邪滋补，扶正固本”的功效，其多糖生物学活性未见详细文献报道，目前泰山医学院药学院已从中提取出多糖粗品，本文通过动物体内实验方法观察桑黄粗多糖对小鼠机体非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1动物与给药 健康昆明小鼠40只，随机分成蒸馏水组，桑黄多糖高、中、低剂量组，每组10只，灌胃给药。蒸馏水组每日灌服蒸馏水0.4ml，桑黄粗多糖高、中、低剂量组，分别按300mg.kg-1.d-1、200mg.kg-1.d-1、100mg.kg-1.d-1灌服多糖蒸馏水溶液，连续灌胃给药12天。

1.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定 第10天腹腔注射3%可溶性淀粉溶液1ml。停药5h后处死。腹腔注入肝素生理盐水溶液2.5ml，剪开腹部皮肤，抽取腹腔液少许滴于玻璃片上，37。C培养1h,生理盐水洗去非贴壁细胞，制成单层腹腔MΦ片，将准备好的8×106/ml浓度的酵母菌液2滴覆盖于单层腹腔MΦ片上，37。C培养40min，无菌生理盐水洗去未被吞噬的酵母菌，固定液固定3min，盐水冲洗、干燥、瑞氏染色，镜下计数100个巨噬细胞，算出吞噬百分率和吞噬指数。

1.3小鼠体内淋巴细胞转化率的测定 第10天开始按10mg/kg肌肉注射PHA生理盐水溶液0.2mg/0.1ml，末次给药后2h，小鼠剪尾取血，推片，姬姆萨—瑞士染液染色5分钟，蒸馏水漂洗，晾干。油镜下观察外周血淋巴细胞转化情况。

1.4小鼠血清半数溶血素水平测定 第4天腹腔注射5%鸡红细胞(CRBC)生理盐水混悬液0.2ml，进行免疫，末次给药后5h，眼眶取血1ml，离心取血清10ul，生理盐水稀释200倍，稀释血清1ml与5%鸡红细胞悬液0.5ml、10%的补体1ml混合，37oC孵育30min，0oC放置20min。另取不加血清的空白对照，离心取上清1ml，加都氏试剂3ml，室温放置10min。取5%CRBC0.25ml、都氏试剂3.75ml于另一试管内，室温放置10min，为CRBC半数溶血管。于分光光度计540nm处以对照管做空白，比色，分别测各管OD值。

1.5小鼠免疫器官重量测定 实验小鼠每天灌胃给药1次，连续给药12天。停药后5h处死，无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，立即用电子天平称量各器官湿重(精确到0.01克)，下列公式计算脾指数和胸腺指数。

2 结 果

2.1高、中、低剂量桑黄粗多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(见表1)

2.2高、中、低剂量桑黄粗多糖对小鼠外周血淋巴细胞转化率的影响(见表2)

2.3高、中、低剂量桑黄多糖对小鼠血清半数溶血素水平的影响(见表3)

2.4高、中、低剂量桑黄多糖对小鼠胸腺指数、脾指数的影响(见表4)

2.5高、中、低剂量桑黄多糖对小鼠细胞因子TNF-α、IL-4的影响(见表5)

表1 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率与吞噬指数的影响

注：与蒸馏水对照组比较，*P<0.01

表2 对小鼠外周血淋巴细胞转化率的影响

注：与蒸馏水对照组比较，*P<0.01

表3 对小鼠血清半数溶血素水平的影响

注：与蒸馏水对照组比较，*P<0.05

表4 对小鼠胸腺指数、脾指数的影响

注：与蒸馏水对照组比较*P<0.01，与蒸馏水对照组比较**P<0.05

表5 对小鼠细胞因子TNF-α、IL-4的影响

注：与蒸馏水对照组比较，*P<0.05;与蒸馏水对照组比较,比较**P>0.05

3 讨 论

多糖类物质的研究热点，是对免疫功能的影响。多糖不仅能有效激活免疫细胞、提高机体免疫能力,而且对宿主正常细胞没有直接的毒副作用,因此被认为是一种重要的生物效应调节剂。

巨噬细胞是体内执行非特异性免疫的主要细胞,是早期肿瘤免疫监视机制中起重要作用的效应细胞，本实验表明，桑黄粗多糖的高、中、低剂量给药均能显著提高小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数(与蒸馏水组比较P<0.01)，提高小鼠腹腔巨噬细胞功能，从而反映出桑黄粗多糖对小鼠非特异性免疫功能具有明显促进作用。此外多糖还具有提高特异性免疫功能的作用，血清溶血素水平是反映机体体液免疫的一个指标，在本实验中，桑黄粗多糖高、中、低剂量给药均能提高小鼠血清半数溶血素水平(与蒸馏水组比较P<0.05),显示了对机体特异性体液免疫的增强作用。另外胸腺指数与脾指数是反映机体免疫功能的重要参数，本实验中测定胸腺指数与脾指数的结果与小鼠各项免疫指标平行，桑黄粗多糖高、中、低剂量给药均能提高小鼠胸腺指数、脾指数(与蒸馏水组比较P<0.05)，从而提示桑黄粗多糖确具备免疫增强剂的功效。

在细胞免疫方面，大量研究表明多糖的作用类似一种典型的T细胞激活剂,它在体内和体外均能促进特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的产生,并提高CTL的杀伤活性，增强NK细胞及淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)的活性。在T细胞免疫功能中，辅助性T淋巴细胞(Th)是免疫调节、免疫监视的核心,而活化的Th细胞按其功能和分泌的细胞因子的不同主要分为Th1和Th2细胞,其中TNF、IFN-r和IL-4分别是Th1和Th2细胞特征性细胞因子，相应细胞因子可促进本亚群和抑制另一亚群的生长分化。Th1细胞正向调节细胞免疫，产生的TNF、IFN-r等能通过上调MHC抗原、B7免疫共刺激分子、凋亡结构等重要的细胞表面蛋白,激活MΦ,并能抑制Th2细胞的增殖或改变树突状细胞的活化和抗原提呈等机制来抑制Th2反应,Th2细胞则主要分泌IL-4、IL-5,诱发肥大细胞的生长、分化和免疫球蛋白生成,在变态反应中发挥一定作用，由此可见Th1细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，关于多糖对此类细胞作用研究，在以往文献中少有报道。本实验提示，桑黄粗多糖高、中、低剂量给药均能提高小鼠外周血淋巴细胞转化率(与蒸馏水组比较P<0.01)，此外本实验还选定Th1、Th2细胞的两个特征性细胞因子TNF-а、IL-4，对其在荷瘤小鼠血清中含量进行检测，以反映两类细胞功能，结果表明桑黄粗多糖高、中、低剂量给药均能提高荷瘤小鼠血清TNF-а含量(与蒸馏水组比较P<0.05)，而IL-4含量虽均高于蒸馏水对照组，但并无统计学差异(P>0.05),提示桑黄多糖高、中、低剂量均能提高特异性细胞免疫功能，其中对Th1细胞功能提高较为明显，而对Th2细胞功能影响较弱。

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