双光子显微镜技术在脑功能研究中的应用：脑片、整体脑结构样品和活体脑

张静思,孙长凯,朴 花

(1.大连医科大学 七年制临床医学系2005级，辽宁 大连116044；2.大连医科大学 生理学教研室和脑疾病研究所，辽宁 大连 116044)

在荧光显微镜领域中，双光子显微镜(two-photon laser scanning microscopy,TPLSM)在过去20年里是一种不可或缺的工具，TPLSM的优势在神经科学的离体和活体组织研究中发挥着重要的作用。

TPLSM图像具有鲜明的高对比度，结合其内在三维分辨率及对生物组织的优越穿透深度，使该技术的应用非常广泛[1]。脑结构成像是神经科学领域重要的研究方法之一，它为脑组织的形态及功能研究提供重要依据。但脑组织的密度、复杂性及其对光线的散射作用，给高分辨率的光学成像和生物活性化合物(笼状化合物)的活化过程造成了障碍，而双光子显微镜的应用可有效减少这些障碍[2,3]。1990年，Denk等[4]最先使用飞秒脉冲激光对TPLSM的作用进行了测试和应用：两个光子的同时吸收使TPLSM具有内在的三维成像功能，荧光激发及光漂白的发生均被限制在聚焦平面处。此外，TPLSM在光化学尤其是光解释放笼状分子方面的优势更为突出。TPLSM的上述优势使其在对脑组织结构成像的过程中较单光子显微镜有了长足的进步。

1 双光子显微镜的一般概况

Ania Majewska等研究并介绍了他们将共聚焦系统改造为双光子显微镜的过程，这一系统包括激光器、光学平台和显微镜。改装过程相对简单，可在短时间内完成。改装所得的激光扫描显微镜很灵活，较商业双光子装置花费少。双光子显微镜能将荧光基团的激发局限于一很小的聚焦平面内，该特性使双光子显微镜较单光子共聚焦显微镜具有如下优点：(1)增加了激发光线的穿透深度。TPLSM联合荧光钙指示剂，使对活体大鼠的体内研究深度达到了500 μm处的锥体神经元；(2)因为聚焦平面外不会产生荧光，观察过程中显微镜不需要针孔，所以荧光收集的效率得以提高；(3)双光子激发显著降低总体光漂白和光损伤效应，从而实现了长时间的成像。Squirrell 等人使用TPLSM研究仓鼠胚胎内的线粒体动态分布，频繁成像时间可长达24 h，而单光子共聚焦成像8 h即会造成明显的组织损伤；(4)局限化的激发可用来光解笼状化合物。如可用来研究Ca2+相关的亚微米级研究领域对Ca2+的释放作用，包括一些离子门控通道，Ca2+敏感的酶类及Ca2+依赖性细胞生理过程等；(5)通过对荧光光致漂白恢复过程的观察，可对具有荧光基团的物质进行研究，如观察大鼠海马切片中树突棘和树突干之间的物质交换及神经营养因子的弥散率[5]。共聚焦显微镜和TPLSM的比较性研究显示，目前一些共聚焦显微镜因其光线不够充分，从而不能使后焦平面得到有效均匀的照明，这是影响共聚焦显微镜最终分辨率的一个限制因素。并且，扩大共聚焦显微镜的针孔不但不会带来宽视野分辨率，反而会使分辨率较宽视野显微镜更低。相反的，在双光子和二次谐波显微镜的实际应用中没有针孔和理论上的限制因素的存在。对于TPLSM，照射后焦平面的光线是十分充足的，因而完全解决了上述影响最终分辨率的限制因素，在TPLSM的实际应用中将不会造成任何障碍。总之，“共聚焦”这一技术上提高的全部优点均能在非线性(双光子和二次谐波)显微镜得到充分的体现[6]。

2 双光子显微镜在神经组织切片和整体分离样品中的应用

神经组织的切片研究尽管有其局限性，但目前仍在神经科学研究中占有重要的地位。在大鼠海马结构急性切片研究中，TPLSM和全细胞膜片钳的联合应用证实基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在棘突增大和突触强化过程中起必不可少的作用。实验中，结合双光子长时间成像和全细胞膜片钳记录可同时监测CA1神经元的棘突大小及突触反应(兴奋性突触后电位)。在长时程增强的过程中，MMP-9的作用是一种局部的、指导性的细胞外信号，此信号可以协调地巩固突触结构和功能性的修饰，确保这些对于学习和记忆有重要意义的修饰的持续性。这里描述的嗅球细胞可塑性机制有可能是MMP-9参与认知功能的有力的论证[7]。

应用双光子激发显微镜对活体急性切片中的呼吸性神经元进行钙成像。样品中包含前包钦格复合体，前包钦格复合体中含有对呼吸节律的产生有重要意义的神经元。传统荧光成像的时间分辨率是充分的，可达10 Hz，甚至更好，但因聚焦点外荧光的影响，传统荧光显微镜的z轴分辨率受到了限制。双光子激发显微镜可有效解决这一问题，因为它的激发过程局限在围绕聚焦平面的很小的范围内(尽管z轴的分辨率依旧低于x或y轴)。但是，针孔滤过技术的一个缺点就是时间分辨率较低。此实验结合细胞类型特异性表达荧光蛋白的转基因小鼠的活体急性切片样品、双光子激发显微镜及钙指示剂染料，证实甘氨酸的抑制作用在功能上与前包钦格复合体驱动的网络活动是一体性的，因而，局部甘氨酸抑制环路对于呼吸节律的产生和维持具有重要意义[8]。

在有关锥体细胞水通道的实验中，有研究者应用TPLSM对锥体细胞的胞体、树突及棘突进行了观察，且对切片内深达60～150 μm的苔状纤维进行了20 min的成像过程。该实验表明神经元缺少功能性的水通道蛋白，从而使其在渗透压急剧变化时仍能保持一定的体积。然而，在这一应用过程中，TPLSM表现出一些不足，如切片体积的变化会使聚焦平面上的神经结构移位(尽管这种移位本身也是胶质细胞体积变化的一种指示)。另外，缺氧缺糖情况下经常能观测到荧光物质的褪色，这也会给成像造成一定的困难[9]。

人们推测嗅球的中间神经元可调节它的输入和输出，但尚不清楚中间神经元对嗅球功能所起的具体作用，且人们对新生中间神经元的功能了解得更少。有研究者在此展示了一种新方法，这种方法可用来研究小鼠嗅球内大量新生颗粒细胞的空间分布模式。应用双光子显微镜在单细胞的分辨率水平上对嗅球冠状切片(250 μm)进行半自动成像是该方法的基础。这一方法可辨别出嗅球内数千个标记神经元的确切位置，因此可降低抽样误差。为了验证概念，研究者对两个嗅球中的新生颗粒细胞进行了成像和分析。结果证明这种大规模的三维分析可以揭示较薄组织切片不能提供的信息。在研究过程中，尽管双光子成像经证实可以穿透厚组织深达500 μm以上，但对深部组织的成像，其质量也有一定的下降，尤其在嗅球中。当对嗅球切片175～200 μm以上深度进行成像时，图像显示的荧光较弱且绿色荧光标记蛋白较少。检测到的细胞密度降低是由于释放的光学信号减弱所造成的，只有最亮的细胞才可被检测到。这一问题在不同的组织中是不同的，所以在不同的样品中应进行不同的评估[10]。

尽管器官切片和培养等方法在神经科学研究中十分重要，但它们固有的一些不足也是不容忽视的。在器官切片培养的条件下，神经元及其网络的很多特性都不能正常发育，如星形胶质细胞的成熟过程。另外，神经元形态的发生有赖于多种因素，而这些因素是很难在体外模拟的，诸如神经元的活动模式、神经营养因子及神经调节系统的存在。因此，对完整脑结构进行研究对神经科学的发展具有重要意义[11]，故目前在整体情况下进行的研究日益增多。将鼠断头取脑后，将脑置于用含氧和蔗糖的冷人工脑脊液浸泡过的滤纸上。然后将其置入盛有人工脑脊液的培养皿中，沿中线切开。将海马和覆于其上的新皮层从脑干上分离。再用解剖刀将海马及新皮层从剩余脑组织上分离下来。将一尼龙刷放进侧脑室将海马结构从覆盖着的新皮质中卷出来然后在下托部位切断。制备新皮质和海马的整体结构样品的目的在于创建一种既有脑片优点(如保持了神经元固有的特性)，又可避免心脏和呼吸运动影响的标本。另外，这些标本还有一些重要的新品质，如保存了局部所有的输入和输出途径、避免了切片和三维组织结构保存时所造成的表面损伤。此外，也证实了这些整体样品的长期(hours)活力。TPLSM成像技术可对整体样品从表面至400 μm的深度进行观察，见图1[12]。这些样品和双光子显微镜技术的结合无疑会为神经科学的整体研究工作带来新希望。

3 双光子显微镜在活体动物的完整脑结构中的

应用

如今，双光子显微镜已更多的用于观测活体动物的完整脑结构，从而为研究提供进一步的便利。以胶质细胞的研究为例，为明确星形胶质细胞在信息处理中的作用，研究者面临的主要挑战正是从半完好的样品研究转向活的、整体动物，以使星形胶质细胞的活动处于与皮质网络活动直接相连的条件下。因为星形胶质细胞不能像神经元一样通过电生理学方法来研究，TPLSM成像技术成为一种重要的替代方法，它的激发光线可以轻易的透过皮层组织，深达约150 μm，且不会造成明显的组织损伤[3]。又如，在小鼠局灶性缺血模型的相关研究中，TPLSM也起到了非常重要的作用。此模型的制备提供了TPLSM对体内脑组织进行成像的一种方法：将小鼠颅骨厚度减小至≈20 μm。此削薄技术不会造成神经结构的改变，同时TPLSM的成像深度自软脑膜表面可深达约100～200 μm，最后，获得的图像可进行选择性三维重建。该模型使研究者能同时监测栓塞物的发展和活体小鼠中树突结构对缺血发生的反应及变化[13]。最近，对小鼠新皮质体验-依赖性结构可塑性的研究中，研究者也利用了活鼠体内TPLSM成像技术[14]，以脊柱受损小鼠为模型，定量研究其血管和轴突网络的动态变化。研究者发明了一种专门的非侵入性体内成像流程，它可检测脊柱内受损轴突的变性和再生的动态过程，同时它也可对同一动物血管网的变化进行监测。以往研究中常难以区分存活轴突和新生轴突，重复成像过程提供了区分存活的轴突和新生轴突的一种独特方式。实验发现，再生的轴突在生长过程中倾向于与血管紧密接触，因为血管在营养方面为轴突提供了获得适宜环境的快速通道。这种亲和性持续的时间超过了血管生成反应的高峰期，同时也涉及到非新生血管，如足背静脉。这种神经血管间的相互作用增加了轴突萌芽的动力，也使轴突延长的速度达到了惊人的程度(高达80 μm/h)。这种体内延时实验鲜明的突出了这一现象。而实验过程中由于组织光学特性的限制，穿透深度仅达脊柱背索表面的200 μm，这些部位的血管形成在控制条件下是比较适宜的[15]。

图1 双光子显微镜对小鼠整个海马结构中齿状回的成像(A)完整海马齿状回的颗粒细胞层和分子层。颗粒细胞的树突从胞体发出直达分子层并向外朝着表面。箭头示从颗粒细胞胞体延伸出的轴突远离表面；(B)齿状回颗粒细胞在较高放大倍数时的成像。箭头示离开胞体的轴突。树突延伸自胞体的其它面并朝着海马结构的表面行进Fig 1 Dentate gyrus of the mouse whole hippocampal formation (HF) imaged with 2PLSM(A) Granule cell layer and molecular layer of the dentate gyrus in the intact hippocampus.The dendrites of the granule cells extend from the cell body through the molecular layer and out towards the surface.The arrow indicates an axon extending from a granule cell body away from the surface；(B) A higher magnification image of granule cells in the dentate gyrus.The arrow indicates the axon exiting the cell body.The dendrites extend from the other side of the soma and travel toward the surface of the hippocampal formation

用双光子激光切断脊柱中绿色荧光蛋白标记的单根感觉神经元轴突，可造成较小的损伤，且周围神经组织中形成的瘢痕也较小。在研究感觉神经元再生能力时，利用了双光子损伤模型。研究表明，周围损伤将导致中央损伤的感觉神经元中再生相关性基因上调。经外周轴突损伤处理过的背根神经节神经元，在中央损伤之前已表达了轴突生长所必须的分子。应用体内成像技术发现，经条件处理(外周轴突损伤)的轴突迅速开始生长，并在48 h内，组织瘢痕尚不明显的情况下穿越损伤部位。研究数据证明，背根神经节神经元的慢性损伤可引发强大的再生潜力。然而，生长能力的实现会因损伤部位的创伤性改变而受阻。结果提示，诱导的条件效应，结合一定的干预来减少瘢痕抑制神经元生长的本性，这将为慢性脊柱损伤提供极具前景的治疗方法[16]。

尽管人们已确信，神经元活动是动物行为最为主要的一个决定性因素，但星形胶质细胞的激活与动物行为间的关系仍不明了。小脑伯格曼胶质细胞是放射状星形细胞，它们参与运动行为，且有钙离子激发活性。然而，以往少有人探讨动物行为中这些细胞中的钙离子激发。通过双光子显微镜，研究者发现在清醒活动中的小鼠，伯格曼胶质细胞表现出三种形式的钙离子激发，其中两种发生在小脑蚓部。当小鼠表现为运动时，至少有上百个伯格曼胶质细胞网络中出现了协调性的钙激发，这些细胞网络的范围可达几百微米甚至更多。麻醉、阻断神经活动或谷氨酸传输均可破坏钙离子的协调性激发。由此可得出，伯格曼细胞的大网络可被特定的动物活动所激活，并有可能通过足量振幅的激活来启动脑组织动力学或血流的宏观变化。研究者发明了一种双光子成像方法，对清醒状态下、头部固定的小鼠小脑进行成像。在此过程中，小鼠可在健身球上移动，研究者就可以探讨觉醒状态和运动行为是如何影响正常情况下伯格曼胶质网络中钙离子的激发,见图2[17]。

图2 对行为小鼠小脑皮质的双光子显微镜检查

用双光子显微镜检查觉醒着的头部受限且使用健身球的小鼠。小鼠的运动通过光编码器示踪，此编码器对运动的开始/偏移、速度及方向提供敏感、定量、可重复的示值读数。此外，通过录像记录小鼠的行为
Fig 2 Two-Photon Microscopy in Cerebellar Cortex of Behaving Mice

Two-photon microscopy in awake,head-restrained mouse using an exercise ball.Mouse locomotion is tracked by an optical encoder on the ball,which provides a sensitive,quantitative,and repeatable readout of running onset/offset,speed,and direction.In addition,mouse behavior is recorded by a video camera

在一定范围内，正常组织生成局部信号的方式之一是多个伯格曼神经胶质细胞的突起部位同时产生自发性钙波。利用TPLSM技术，研究者首次展示了在活体完整的脑组织内，嘌呤型机制可以激发细胞间的钙波传递[18]。

4 双光子显微镜技术的局限性和未来发展趋势

尽管双光子显微镜被广泛应用于不同的研究体系中，但它仍受限于一个相当小的光谱窗口。目前，双光子显微镜的光源依旧是Ti：Sa飞秒激光提供的大约在700～1000 nm之间的输出。因此，双光子的有效激发波长局限于350～500 nm之间。S.Quentmeier提出克服这些局限的方法之一就是将双光子激发扩展为双色双光子激发。双色双光子激光扫描显微镜(two-color two-photon laser scanning microscopy,2c2pLSM)的试验装置中，使用的是Ti：

Sa 800 nm的基本输出和400 nm的二次谐波。这些光柱在时间和空间上的重叠可以达到双色双光子的吸收和266 nm的有效激发波长。因此，使用2c2pLSM的显微镜其激发范围可以达到紫外光，如230～330 nm。因为此范围刚好适合于色氨酸的吸收光谱(色氨酸是一种与大多数固有的蛋白荧光相关的氨基酸，色氨酸相当于一种自然的内置监测器)。因此，2c2pLSM显微镜不仅可以检测非标记的蛋白质，而且可以监测蛋白质的反应及构象变化。

使用280 nm光线单光子激发色氨酸是最显著的方法，但在共聚焦或宽视野荧光显微镜中使用这一波长进行激发会引起很多问题，包括紫外线的光毒性、短波长光线的散射问题，以及所需的特殊光纤、具有理想孔径的物镜的限制。相比之下，2c2pLSM较小的激发面积和较长的波长可以解决这些问题。研究者展示了MIN 6(Pancreatic β cell line,MIN6)细胞的第一张2c2pLSM荧光图像，从而证实了该方法在活细胞内紫外荧光基团成像过程中的实用性。另外，有研究者使用时间门控相机结合检流计-光学光束扫描(galvo-optic beam scanning)证实了2c2pLSM可监测生物素与亲和素的结合过程[1]。

相信在未来的发展过程中，双光子显微镜在神经科学及诸多其他科学领域中的应用前景将会更加宽广。

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