116株结核分枝杆菌链霉素耐药菌株 rspL和rrs基因突变特征研究

谢彤 李桂莲 巨韩芳 赵德福 赵慧 穆成 王撷秀

(天津市结核病控制中心 天津 300011)

链霉素为氨基糖苷类抗生素,主要作用于16s RNA,干扰蛋白质的翻译,抑制蛋白质合成。已经证实链霉素耐药相关的基因主要为编码核糖体蛋白S12的 rpsL基因和编码16sRNA的 rrs基因。在一些地区研究发现链霉素耐药株的传播与M TB北京基因型密切相关[1]。本研究旨在阐明天津地区链霉素耐药M TB菌株 rpsL和rrs基因突变位点以及突变率是否与北京家族基因型相关。

1 资料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究中包括116株链霉素耐药菌株和10株全敏菌株,所有菌株均来自于本室保存的2008年1月—2009年6月在天津市结核病控制中心以及天津市10个区县结防机构就诊的结核分枝杆菌分离培养阳性肺结核患者。

1.1.2 主要试剂 比例法药敏培养基购自珠海贝索生物技术有限公司;Probest Taq酶为宝生物工程有限公司产品;细菌基因组提取试剂为上海生工生物有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 基因组提取 从L-J固体培养基中挑取M TB培养物3～4环加入盛有400μl 1×TE缓冲液的 Eppendorf管中,80℃60 min灭活后,采用CTAB法M TB基因组提取。

1.2.2 M TB北京基因型鉴定 采用多重PCR方法,根据其家族菌株基因组中Rv2816至Rv2819序列缺失进行鉴定北京基因。PCR扩增产物片段长度为393 bp即为北京基因型,570 bp为非北京基因型[2]。

1.2.3 rpsL和rrs基因突变分析 PCR分别扩增rpsL和rrs基因。rpsL基因扩增引物为5′-GA TGACGGCCTTCGGGTTGT-3′ 和 5′-GTTCACCAACTGGGTGAC-3′,产物长度为 622 bp;rrs 基因扩 增引物 为 5′-GA TGACGGCCTTCGGGTTGT-3′和 5′-AGGCCACAAGGGAACGCCTA-3′,产物长度为504 bp。PCR反应在含有200μmol/L dN TP,0.4μmol/L引物,1.5 mmol/L M gCl2,1.5 U Taq酶和10～100 ng基因组DNA的50μL体系中进行。经95℃5min变性后,热循环温度条件为95℃45 s;60℃1min;72℃1min,共30个循环,上海英骏生物技术有限公司负责引物合成与PCR产物序列分析。使用在线比对软件http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi将测序结果与标准敏感株H37Rv基因序列进行比对,判定基因的点突变位点。

2 结果

2.1 M TB北京基因型鉴定 在本研究中116株链霉素耐药临床分离菌株经多重PCR分析108株为北京基因型,占全部菌株的93.1%,提示北京基因型为天津地区流行的链霉素耐药M TB优势菌株。

2.2 rpsL基因突变分析 116株链霉素耐药株中,rpsL基因发生点突变位点主要集中于43位和88位密码子(表1)。其中70株(60.3%)发生 rpsL 43 AAG→AGG(K43R)突变;15株(12.9%)发生rpsL 88 AA G→A GG(K88R)突变,rpsL基因总突变率为 73.3%(85/116)。此外,所有的耐药株在121位密码子均出现AAA-AAG的无意义突变。106株 M TB北京基因型中67(63.2.%)株发生K43R突变;8株非北京基因型中3(37.5%)株出现K43R突变。K88R的突变类型仅出现在15株北京基因型中,非北京基因型未发现此类突变类型。K43R与 K88R两种类型突变频率在北京基因型和非北京基因型没有统计学差异。在全敏菌株中,除一株发生 AAA-AAG(K121K)无意义突变外,在rpsL基因中未见基因突变。

2.3 rrs基因突变分析 与链霉素耐药相关的另外一个基因 rrs以513 A→C突变为主,2株M TB出现516 C→T。此外,各有1株M TB链霉素耐药株分别出现905 A→G和926 C→G突变(表1)。rrs基因总突变率为14.7%(17/116)。1株菌株rpsL 88和 rrs 926位同时突变。rrs基因突变仅在北京基因型中出现,在非北京基因型中未见 rrs突变。

表1 耐药基因 rpsL和rrs耐药相关基因突变特征

3 讨论

在我国十省市开展的结核病耐药监测研究证实链霉素耐药结核病在我国某些地区流行较为广泛[3]。与链霉素相关的 rpsL基因点突变通常发生在43和88位点。本研究中 K43R的突变频率为60.3%(70/116),低于新加坡地区89%[4],但高于Sreevatsan等人早前54%的报道[5]。在88位点天津地区分离菌株中仅检测到 K88R突变形式,而未见其他研究中常见的 K88Q和 K88T突变[4,6]。此外,值得关注的是天津地区分离的全部链霉素耐药菌株在 rpsL基因121位点均出现了AAA-AAG的无意义突变,而这种突变仅在少量印度流行的耐链霉素菌株中出现[7]。

在越南、新加坡等地研究提示链霉素耐药M TB的传播与北京基因型密切相关[1,8]。Sun等人的最新研究发现在北京基因型链霉素耐药株中 rpsL K43R突变比例高达89%,显著高于非北京非北京基因型(40%),这一结果提示携带 rpsL K43R突变的北京基因型链霉素耐药M TB可能更容易在人群中传播[4]。作为北京基因型高流行地区,天津流行的流行北京基因型链霉素耐药株中,北京基因型与非北京基因型 rpsL K43R突变率差异无统计学意义。因此,本研究结果并不支持Sun等人的推断。天津地区链霉素耐药菌株 rrs的突变率为14.7%(17/116),在北京基因型中 rrs的突变以513 A→C为主(11.2%),而俄罗斯报道链霉素耐药北京基因型 rrs突变以516 C→T为主(占17%)[9],以上研究提示即使在不同的北京基因型高流行地区,链霉素耐药M TB传播机制也并不相同。

综上,天津地区流行的链霉素耐药菌株中 rpsL和rrs 2个耐药相关基因的总突变率为87.7%(101/116),rpsL的突变率为73.3%(85/116),有K43R和 K88R 2种突变方式,这2种突变形式与北京基因型无显著相关性;rrs的突变率为14.7%(17/116),以513 A→C突变为主。

[1]Sun YJ,Lee AS,Wong SY,Heersma H,Kremer K,van Soolingen D,Paton N I.Genotype and phenotype relationships and transmission analysis of drug-resistant tuberculosis in Singapore[J].Int J Tuberc Lung Dis,2007,11(4):436-442.

[2]赵德福,谢彤,巨韩芳,穆成,赵慧.利用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌北京基因株[J],中国防痨杂志,2010,32(6):382-384.

[3]He GX,Zhao YL,Jiang GL,Liu YH,Xia H,Wang SF,Wang LX,Borgdorff MW,van der Werf MJ,van den Hof S.Prevalence of tuberculosis drug resistance in 10 p rovinces of China[J].BMC Infect Dis,2008 8(12):166-173.

[4]Sun YJ,Luo JT,Wong SY,Lee AS.Analysis of rpsL and rrs mutations in Beijing and non-Beijing streptomycin-resistant M ycobacterium tuberculosis isolates from Singapore[J].Clin M icrobiol Infect,2010,16(3):287-289.

[5]Sreevatsan S,Pan X,Stockbauer KE,Williams DL,Kreiswirth BN,Musser JM.Characterization of rpsL and rrs mutations in streptomycin-resistant M ycobacterium tuberculosis isolates from diverse geographic localities[J].Antimicrob Agents Chemother,1996,40(4):1024-1026.

[6]Spies FS,da Silva PE,Ribeiro MO,Rossetti ML,Zaha A.I-dentification of mutations related to streptomycin resistance in clinical isolates of M ycobacterium tuberculosis and possible involvement of efflux mechanism[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(8):2947-2949.

[7]Das R,Gupta P,Singh P,Chauhan DS,Katoch K,Katoch VM.Association of mutations in rpsL gene with high degree of streptomycin resistance in clinical isolates of M ycobacterium tuberculosis in India[J].Indian J Med Res,2009,129(1):108-110.

[8]Anh DD,Borgdorff MW,Van LN,Lan N T,van Gorkom T,Kremer K,van Soolingen D.M ycobacterium tuberculosis Beijing genotype emerging in Vietnam[J].Emerg Infect Dis,2000,6(3):302-305.

[9]Lipin M Y,Stepanshina VN,Shem yakin IG,Shinnick TM.Association of specific mutations in katG,rpoB,rpsL and rrs genes w ith spoligotypes of multidrug-resistant M ycobacterium tuberculosis isolates in Russia[J].Clin M icrobiol Infect,2007,13(6):620-626.