动物源性食品中志贺氏菌的分离与鉴定

游勇来 陈文

(从化出入境检验检疫局 广东从化 510900)

1 前言

志贺氏菌 (Shigella)俗称痢疾杆菌,是引起人细菌性痢疾的肠道病原菌,只需少量就可以发病,极易引起爆发性流行,尤其对幼儿可引起急性中毒性菌痢,死亡率很高,对人类生命安全和社会稳定有较大影响。根据世界卫生组织报道,每年全球痢疾的发病人数高达 2亿,其中 1.632亿分布于发展中国家,是危害最广的流行病之一[1]。我国《传染病防治法》将其规定为乙类传染病。

志贺氏菌可分为 4个血清群 (伯杰手册,1984):A群,痢疾志贺氏菌;B群,福氏志贺氏菌;C群,鲍氏志贺氏菌;D群,宋内氏志贺氏菌。

本文对某注册进出口食品企业原料进行了为期 6个月的常规致病菌检验,结果分离到 1株志贺氏菌,通过对污染情况进行分析,提出适当控制措施,落实从“源头抓质量”的工作要求,为日常监管提供参考,促进检验检疫把关。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品

2009年 8月 ～2010年 1月,在日常监管中,自从化某注册进出口食品企业动物源性食品原料采取样本共 180份,其中牛肉粉 39份、鸡肉粉 52份、猪肉粉 41份、鸡蛋粉 26份、虾粉 22份,取样过程均遵循无菌操作。

2.1.2 培养基和试剂

GN增菌液、HE琼脂、SS琼脂、伊红美蓝琼脂(EMB)、三糖铁琼脂 (TSI)、尿素酶琼脂基础、无菌尿素、肠杆菌科生化鉴定管、氧化酶试纸,均购自广州环凯生物技术有限公司;API 20E试剂条 (法国生物梅里埃生产,有效期内使用,用标准菌株验证结果相符);志贺氏菌属 20种诊断血清 (兰州生物制品厂,有效期内使用,用标准菌株验证结果相符)。

2.1.3 参考菌株

志贺氏菌 (Shigella CMCC51572)、大肠杆菌(Escherichia coliATCC25922),均购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。

2.1.4 主要仪器设备

恒温培养箱 (日本 SL),高压锅 (日本 HIRAYAMA),普通光学显微镜 (重庆光学仪器厂)。

2.2 方法[2]

2.2.1 增菌

无菌称取 25g样品,加入 225mL GN增菌液中,经涡旋振荡器振荡混匀,36±1℃培养 6～8h。

2.2.2 分离及初步生化

(1)用接种环取上述 GN增菌液各 1环,分别划线于 HE琼脂平板、SS琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上,36±1℃培养 18～24h,培养结束后观察菌落生长特征。选择划线区域的数量视样品的污染程度而定,一般以能够分离到单菌落为宜。同时用志贺氏菌和大肠杆菌参考菌株做对照。

(2)挑取可疑单个菌落同时接种三糖铁斜面培养基和葡萄糖半固体管各 1,36℃±1℃恒温培养 18～24h,根据培养情况初步判定是否为志贺氏菌。为防止漏检,至少挑取 4～5个可疑菌落,如果平板上可疑菌落总数少于 5个,则挑取所有可疑菌落进行确认。同时用志贺氏菌和大肠杆菌参考菌株做对照。

2.2.3 革兰氏染色检查和氧化酶试验

对于三糖铁斜面培养基和葡萄糖半固体管均判定为志贺氏菌阳性者,挑取三糖铁斜面培养基上的菌落做常规革兰氏染色后镜检,并做氧化酶试验。同时用志贺氏菌和大肠杆菌参考菌株做对照。

2.2.4 血清型分型及进一步生化试验

2.2.4.1 血清型分型

对革兰氏染色和氧化酶试验均为阴性者,挑取三糖铁斜面培养基上的培养物,做玻片凝集试验。先用 4种志贺氏菌多价血清做凝集试验,如果 K抗原存在而不出现凝集,则将菌液 100℃中隔水煮沸1h再做凝集试验;出现凝集者,再用 A1、A2、B群多价和 D群血清分别试验,然后用群和型的因子血清继续试验直至确定出该志贺氏菌的血清型。

2.2.4.2 进一步生化试验

在血清型分型的同时做进一步生化试验,即葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶、pH7.2尿素、氰化钾生长以及水杨苷和七叶苷的分解。生化反应相符者,进一步做 5%乳糖发酵、甘露醇、棉子糖和甘油发酵和靛基质试验,也可直接将可疑菌株做成菌悬液上 API 20E试剂条进行生化反应。

3 结果

3.1 检出情况

各类样品的志贺氏菌检出情况见表 1。

表 1 各类样品志贺氏菌的检出情况

3.2 分离培养结果

(1)分离到的可疑菌落在 HE、SS、EMB琼脂培养基上呈光滑、圆形,无色半透明,中央无黑心,直径 1.5mm左右的露珠状,与标准志贺氏菌一致。而大肠杆菌在 HE、SS、EMB琼脂培养基培养基上均呈现带颜色的菌落。

(2)分离到的可疑菌落在三糖铁斜面培养基斜面不变色 (不发酵乳糖和蔗糖),底层发酵葡萄糖产酸变黄,不产气;葡萄糖半固体管产酸变黄无动力。与标准志贺氏菌培养情况一致。

3.3 革兰氏染色检查和氧化酶试验结果

分离株革兰氏染色镜检为革兰氏阴性,无芽孢,呈短杆菌状,大小均匀,两端钝圆;氧化酶试验呈阴性。与标准志贺氏菌试验结果一致。

3.4 血清型分型结果

分离株与 4种志贺氏菌多价血清、B群多价血清在 30s内均出现凝集现象,生理盐水对照不出现凝集;用志贺氏菌属群和型因子血清分别检查,发现分离株与 6群因子血清和Ⅲ型因子血清均凝集,生理盐水对照不出现凝集。参考 GB/T4789.5-2003福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原表,判定该分离株血清型为 3a。

3.5 生化鉴定结果

分离株的常规生化反应结果见表 2,API20E生化反应结果见表 3。

表 2 分离株常规生化反应结果

表 3 分离株 API20E生化试验结果

根据表 3结果并通过API20E原始检测记录卡计算得出分离株生化谱为 000400017。利用 API 20E V4.1软件查询鉴定,分离株为沙门氏菌属,%id=97.0%,T=0.96,结果见图 1。

图 1 分离株 API鉴定结果

从表 2和表 3可看出分离株的生化结果符合志贺氏菌生化反应特点。

4 讨论

(1)从待检的动物源性食品原料中分离到的菌落,通过从 HE、SS和 EMB琼脂平板上挑选出可疑菌落,再经三糖铁斜面培养基和葡萄糖半固体管筛选,结合血清学试验和生化鉴定的方法,最终判定为志贺氏菌阳性,属于福氏志贺氏菌,血清型为 3a。

(2)许多学者[3,5,6]多次报道沙门氏菌是污染动物源性食品的最重要病原,特别是在禽蛋产品中广泛存在,金黄色葡萄球菌是另一类污染动物源性食品的常见致病菌,但国内外很少报道从动物源性食品中分离出志贺氏菌。

(3)大肠杆菌属于肠杆菌科埃希氏菌属,不同菌株间 DNA相关性为 80%,而与同科的志贺氏菌属 (除鲍氏志贺氏菌外)的 DNA相关性却达 80%-87%[4]。因此,鉴定过程中应结合多种方式进行确认,以免误判。

(4)Jorgen Schlundt[5]认为动物源性食品中重要的致病菌出现常常与屠宰的动物污染有关,即这些动物在屠宰之前已感染该病菌但临床并不发病即隐性感染;方维焕[6]认为动物源食品中病原微生物的污染源主要来自动物养殖期间的感染和屠宰加工过程中的污染两个方面。因此生产企业应要求原料供应商建立良好的质量控制体系,创造良好的动物饲养环境,防止病原微生物对养殖场及其周围地区的污染,加强对源头动物的隔离检疫,防止检疫不合格的动物污染产品;其次,在动物屠宰或动物源食品加工过程中应避免卫生条件或工人不良的卫生操作等因素污染产品。同时生产企业应加强采购原料的质量验收检验,确保采购的原料质量合格。

(5)检验检疫部门必须采取有效措施,按照《食品安全法》的要求,落实从“源头抓质量”的工作要求,严防不合格原料进入生产环节引起质量事故,影响“中国制造”的声誉。加强对原料的检验检疫、卫生监督和卫生处理,确保卫生处理安全有效,并做好医学媒介生物的采样和取证;加强对从业人员卫生知识的宣传教育,提高其自我卫生保护意识;加强劳动保护,改善劳动环境条件,接种相关疫苗,提高高危人群的抗病和防病能力,确保从业人员的卫生安全。

[1] Villa J,Gascon J,Abdalla S,et a1.Antimicrobiol resistance of Shigella isolates causing traveller’s diarrhea[J].An-timicrob A-gents Chemother,1994,38:2668～2670.

[2] GB/T 4789.5-2003食品卫生微生物学检验:志贺氏菌检验[S].

[3] 崔立.动物性食品中重要致病微生物的 E急性危害[J].饲料工业,2006,27(11):8～10.

[4] 王海艳,刘虹,刘中学,等.菌落粗糙型大肠杆菌的分离与鉴定[J].检验检疫科学,2006,16(6):8～10.

[5] Jorgen S.Emerging Food-borne Pathogens[J].Biomedical And Environmental Sciences,2001,14:44～52.

[6] 方维焕.动物源食品中病原微生物污染的监控[J].动物食品安全,2004,10:20～22.