煮沸裂解法快速提取大鲵DNA

张志敏，刘南君，牛静，李学英

（遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州遵义 563003）

煮沸裂解法快速提取大鲵DNA

张志敏，刘南君，牛静，李学英

（遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州遵义 563003）

目的 建立大鲵基因组DNA快速简便高效的提取方法。方法 借鉴煮沸裂解法制备质粒DNA方法，改进后用于提取大鲵基因组DNA。结果 本方法提取DNA纯度高（A260/A28介于1.7～2.1之间），耗时短（2h），毒性小，分子大小约为23kb，适用于PCR扩增及后续分析。结论 本方法提取基因组DNA纯度高、耗时短、提取所用试剂毒性小、成本低，值得在大鲵基因组DNA提取中使用，也可为其他动物的相关研究提供参考。

大鲵；DNA提取；煮沸裂解法

50年代初，DNA被证明是所有生物最主要的遗传物质。随着生物化学、分子生物学、遗传学的发展，基因工程和各种生物技术创立，DNA的有关技术也得到飞速发展。DNA提取方法成了这些研究和应用中最重要的技术之一。目前已经建立了用于各种不同目的的DNA提取方法，这些方法也被用于生物学，尤其是生物工程的各个方面。但是，对于不同的动植物样品，由于其组织成分的差异，采取的DNA提取方法不完全一致。笔者在实验和研究中，建立了大鲵基因组DNA的提取方法，其操作简单，操作过程毒性小，所提取的DNA纯度高，省时，不需要很昂贵的仪器设备，所提取的DNA适用于分子遗传学中PCR和其他分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料 以十只正常大鲵及八只弯曲病大鲵肝脏为实验对象。大鲵从贵定娃娃鱼养殖公司购买。

1.2 主要试剂与仪器 电子天平、Genex Beta微量加样器、Thermo台式高速离心机、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、微波炉、紫外透射反射分析仪、Biorad PCR仪、海尔冰箱等。试剂：20ug/mL蛋白酶K、1mg/mL胰RNA酶、0.5M EDTA、0.5M Tris-HCL、TE溶液、1%和1.5%琼脂糖凝胶、0.5×TBE、70%乙醇、Gold View溶液、1%SDS、10M醋酸铵溶液、生理盐水等。

1.3 方法 取1g大鲵肝脏组织用生理盐水洗净，尽量控干水分，剪碎，在液氮中研磨成粉状；加入十倍体积裂解液（10Mm Tris-HCL，100MmEDTA，0.5%SDS）混匀分装于EP管中，做10管，每管1mL；加胰RNA酶20ul，37℃1h后加入蛋白酶K 5ul/管，50℃3h，不时混匀；将离心管于94℃沸水浴中精确放置10min；13200rpm离心5min，取上清500ul；加0.2倍体积醋酸铵及2倍体积乙醇，室温下放置5min沉淀DNA，13200rpm离心10min，倾去上清，70%乙醇洗2次，晾干后加1mL溶解DNA。用紫外分光光度计检测所提取DNA样品260nm和280nm OD值，计算纯度。实验重复3次。

1.4 电泳鉴定DNA纯度和完整性 1%琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色，90～100V，30min。检测基因组DNA完整性。

2 结果

2.1 紫外分光光度计检测结果 紫外分光光度计检测纯度：各样品A260/A280值见表1（均值），结果在1.7～2.1之间，纯度符合分子遗传学实验要求。

表1 大鲵基因组DNA紫外分光光度计检测值（X）

2.2 电泳鉴定结果 电泳检测结果如图1，基因组DNA没有降解。DNA分子量约23kb，无杂带和拖尾现象，说明所提取DNA纯度高，无降解。实验重复3次，结果相同（如图1），表明重复性好。

图1 大鲵基因组DNA的直接电泳检测图

3 讨论

DNA是最重要的遗传物质，利用基因工程手段对动植物进行定向改造，已成为当今动植物育种学发展的一个新领域。因此，DNA的提取方法和技术是分子遗传学中最基本的技术，也是生物工程中最常用的技术。为了得到足够纯的DNA进行基因和遗传操作，目前国内外已有许多DNA提取方法，这些方法因研究对象和目的不同而异。苯酚/氯仿法是DNA的提取中应用较为广泛的方法，其对新鲜样品的提取效果比较好。本实验用煮沸裂解法替代传统的苯酚/氯仿抽替，对正常和弯曲病大鲵基因组DNA进行提取。所提取的DNA呈白色絮状沉淀，电泳显示DNA完整，无RNA污染，A260/A280均在1.7～2.1之间，实验操作简单、不需昂贵的仪器设备、用时短（2～3h）、所用试剂毒性小；产品纯度高又适合PCR及其他分子遗传学分析，效果理想。本实验成功建立了大鲵基因组DNA的提取方法，为大鲵的分子遗传学研究打下了基础。

[1]J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南[M].黄培堂等译.北京:科学出版社,2002.36-39.

[2]李长富，葛正龙，黄燮南，等.天麻DNA的快速提取[J].遵义医学院学报，2004,27（3）：226-227.

[3]李学英,王大忠,王乾兴.一种改进的鲇鱼基因组DNA的高效提取方法[J].遵义医学院学报，2001,24（1）：19-21.

Boiling lysis quickly separation of Giant Salamander DNA

ZHANG Zhi-min,LIU Nan-jun,NIU Jing,LI Xue-ying
（Department of Cell Biology,Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563003,China）

ObjectiveTo found a quick,simple,efficient separation method of Giant Salamander genome DNA.MethodsBased on the boiling lysis method of plasmid DNA separation,improved the protocol for Giant Salamander genome DNA extraction.ResultsThe A260/A280 of DNA extracted from Giant Salamander was pure highly（between 1.7 and 2.1）.It took very short time（2h）and have low toxicity of reagent.The fragment of extracted DNA was about 23kb and it was suitable for PCR and subsequent analysis.ConclusionsThis method was at high pure,short time,harmless,low cost,and fit for extracting of Giant Salamander genome DNA,and also be used to similar studying in other animals.

Giant Salamander；DNA extraction；boiling lysis

R394.33

A

1000-2715（2010）05-0424-02

2010-01-20

张志敏（1979—）,女,贵州省遵义人,副教授,研究方向:分子遗传学。

李学英（1966—）,女,硕士,教授,硕士生导师。

李 勇]