七氟醚对大鼠缺血再灌注心肌凋亡相关基因表达的影响

陈根殷　王旭光　杨　展　陈淑琼

【摘要】 目的 探讨七氟醚预处理对大鼠心脏缺血再灌注过程中心肌细胞Bcl-2及Bax 基因表达的影响。方法 24只SD大鼠随机分成3组(n=8)：假手术对照组(C组)、缺血再灌注对照组(IR组)和七氟醚预处理组(s组)。IR组与S组接受左冠脉3 h阻断和3 h再灌注。七氟醚预处理组在缺血前吸入七氟醚，30 min后洗脱15 min。取心肌缺血区组织，RT-PCR测Bcl-2及Bax基因的mRNA表达，免疫印迹法(Western-blot)测蛋白表达。结果 与C组相比较，IR组和S组Bcl-2的mRNA和蛋白表达均下调，而S组高于IR组；Bax的mRNA和蛋白表达IR及S组均高于C组，IR组则高于S组。结论 七氟醚预处理抑制心肌细胞凋亡可能与上调Bd-2基因的表达、下调Bax基因的表达有关。

【关键词】

七氟醚；心肌；心肌再灌注损伤；凋亡

Effected of sevoflurane pretreatment on myocardial Bcl-2 and Bax gene expression during ischemia/reperfusion in rats

CHEN Gen-yin,WANG Xu-guang,YANG Zhan，et al.Department of Anesthesiology，First Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang，Guangdong 524001，China

【Abstract】 Objective To investigate the effects ofpretreatment with sevoflurane on myocardial Bcl-2 and Bax gene expression during ischemia-reperfusion in rats.Methods 24 SD rats were randomly divided into 3 groups with 8 animals in each group:sham operation group(group C); ischemia-reperfusion group(group IR)，sevoflurane group(group S).In group IR animals were subjected to 3 h of ischemia by 3 h reperfusion.In group S animals inhales 2%sevoflurane for 30 min followed by 15 min of wash-out before IR.In group C animals underwent no I/R.Myocardium was obtained from marginal zone of ischemic area.The mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax gene were detemined by RT-PCR and western-blot.Results The expression of mRNA and protein expression of Bcl-2 were upregulated in group S and group IR compared with that in group C.The expression of mRNA and protein expression of Bax were down-regulated in group S and group IR.The expression of Bcl-2 gene in group S was higher than tha t in group IR While the expression of Bax gene was lower.Conclusion Sevoflurane pretreatment inhibits myocyte apoptosis inIR myocardiumpartly by modulation of expression of Bcl-2 and Bax genes.

【Key words】Sevoflurane；Myocardial；Myocardial reperfusion injury；Apoptosis

研究已表明吸入性麻醉药预处理能模拟缺血预处理效应减轻缺血再灌注所致的心肌损伤［1-3］，但这种心肌损伤保护机制至今尚未完全清楚，有研究证明这与减少缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡的发生有关［4］，但其抑制细胞凋亡的机制至今不甚明确。本研究观察七氟醚预处理对大鼠心脏缺血再灌注过程中心肌细胞Bcl-2及Bax 基因表达的影响，探讨其心肌保护作用机制与凋亡调控基因的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、DMSO、DEPC(Sigma公司)；Trizol(Invitrogen公司)；RT-PCR 一步法试剂盒(宝生物(大连)工程有限公司)；GAPDH、Bcl-2、Bax引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；100 bp DNA marker、TEMED、6×上样缓冲液(华美生物工程公司)；ECL试剂、Aprotinin(上海华舜生物工程有限公司)；β-actin大鼠多抗IgG、Bcl-2大鼠单抗IgG、Bax大鼠单抗IgG、辣根酶标记山羊抗大鼠IgG(Santa Cruz公司)； PVDF膜 (美国Pall Gelman公司)。

1.2 实验分组 健康成年SD大鼠(250~300 g) 24只，雌雄不限，随机分成假手术对照组(C组)、缺血再灌注组(IR组)、七氟醚预处理组(S组)，每组8只。C组不进行缺血再灌注处理。IR组阻断冠脉3 h，随后再灌注3 h。七氟醚预处理组用麻醉机吸入2%七氟醚30 min后，洗脱15 min，然后阻断冠状动脉3 h，再灌注3 h。其余步骤同对照组。吸入麻醉药组在吸入麻醉药期间停用静脉麻醉药，以维持麻醉水平相对稳定。以上各组动物实验完毕后，从心底部剪取各组动物心脏，切下心室，用于总RNA和蛋白提取。

1.3 模型制备 大鼠肌内注射氯胺酮70 mg/kg。颈部正中分离气管并切开插管，动物呼吸机进100%纯氧机械通气，控制呼气末CO₂分压在4~4.5 kPa之间。分离颈外静脉置管，持续滴注乳酸林格氏液20 ml/(kg•h)，必要时加少量碳酸氢钠以维持血液pH值在7.35~7.45之间。麻醉维持用微量泵泵注咪唑安定0.05~0.1 mg/(kg•h)，氯胺酮2~5 mg/(kg•h)和维库溴胺0.05~0.1 mg/(kg•h)。分离颈动脉，置管连接换能器测压。正中劈开胸骨，切开心脏，缝线绕过左冠状动脉前降支近端深面并胶管将其套住。拉紧套管即阻断冠状动脉，表现为心肌局部青紫，心电图ST段上升。放松套管，局部反应性充血，表明心肌再灌注。如果发生室颤，用食指轻叩右室壁除颤。

1.4 观察指标及测定方法

1.4.1 RT-PCR测心肌Bcl-2和Bax mRNA表达

将大鼠心脏剪碎，加液氮研磨，用Trizol试剂提取心肌总RNA，按一步法试剂盒步骤进行RT-PCR。Bcl-2引物为：上游5'-GCTACGAGTGGGATACTGGAG-3'，下游5'-GACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'，产物长度为559bp，反应条件为：50℃逆转录30 min；94℃预变性2 min；94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸45 s，扩增30个循环；72℃延伸10 min。 Bax引物为：上游5'-CATCCAGGATCGAGCAGAGAG-3'，下游5'-AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACC-3'，产物长度为262 bp，反应条件为：50℃逆转录30 min；94℃预变性2 min；94℃变性30 s，52℃退火50 s，72℃延伸45 s，扩增30个循环；72℃延伸10 min。 退火温度52℃；内参照GAPDH上游引物： 5'-CCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3'，下游引物:5'-GCAGTGATGGCATDDAC TGTGGT-3'，扩增片段长度442 bp，反应条件为：50℃逆转录30 min；94℃预变性2 min；94℃变性40 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，扩增30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，GDS 800凝胶成像分析系统观察结果并拍照，同时进行光密度分析。以Bcl-2或Bax PCR产物与内参照β-actin PCR产物的光密度之比作为Bcl-2或Bax mRNA的相对含量值。

1.4.2 免疫印迹法测心肌Bcl-2和Bax 蛋白表达 参考文献方法提取心肌蛋白［5］。取50 μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10%SDS PAGE；电转移至PVDF膜；用含5%脱脂奶粉的TBS(pH 8.0)封闭2 h；分别加入适量Bcl-2大鼠单抗IgG (1:400)或Bax大鼠单抗IgG(1:400)或β-actin山羊IgG多克隆抗体(1:400)，摇床上室温反应2 h；洗膜3次，每次20 min；加辣根过氧化物酶标记的二抗(1:6000)，室温反应2 h；洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。结果用GDS 800凝胶图像系统进行扫描分析，记录平均灰度值。计算目的蛋白与内参照β-actin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。

1.5 统计学方法

计量资料表示为(x±s)，采用SPSS11.0统计软件进行分析，行单因素方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织Bcl-2和Bax mRNA表达情况

RT-PCR结果显示(图1)及图像分析结果显示(表1)，与C组相比较，IR组和S组Bcl-2 的mRNA表达均下调，S组高于IR组；而Bax的mRNA表达IR及S组均高于C组，IR组高于S组。

2.2 各组大鼠心肌组织Bcl-2和Bax 蛋白表达情况结果表明(图2，表1)，Bcl-2基因的蛋白表达量IR及S组均较C组下降，S组高于IR组。Bax基因的蛋白表达量IR及S组均高于C组，IR组高于S组。

3 讨论

目前认为吸入性麻醉药的心肌保护作用机制有多因素参与，细胞凋亡机制是其中一个重要因素。研究表明，在动物缺血模型中，缺血再灌注引起的心肌损伤都有细胞凋亡的参与。近年来动物实验观察到吸入性麻醉药对IR心肌细胞凋亡有抑制作用，与缺血预处理相似的保护效应［6］。但其抑制细胞凋亡的机制至今不甚明确，尤其对细胞凋亡的基因调控有何影响，还需进一步研究。

心肌细胞凋亡的调节基因主要有C-Myc、p53及Bcl-2家族。其中Bcl-2基因家族是一类结构相似包含两类功能相反的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因如Bcl-2、Bcl-XL和Al等，另一类是促进细胞凋亡的基因如Bax、Bak、Bok、Bcl-Xs等。Bcl-2可通过抑制自由基的产生及细胞内钙超载，抑制线粒体膜的通透性，阻止细胞色素C的释放及抑制线粒体凋亡诱导因子等机制发挥抑制细胞凋亡的作用。Bcl-2过表达时能完全抑制脂质过氧化，从而对IR心肌具有强大的抗细胞凋亡作用［7］。Bax的作用正与Bcl-2蛋白相反，促进细胞凋亡［8-9］。Bcl-2和Bax两者的比例决定细胞是生存还是凋亡，当Bcl-2增多时形成Bcl-2同源二聚体，细胞受到保护；当Bax增多时形成Bax/Bcl-2异源二聚体，细胞趋向凋亡。I/R心肌细胞凋亡的确切机制目前还未十分明确，目前认为，IR所致的心肌细胞内钙超载，产生的大量氧自由基及多形核中性粒细胞的积聚是IR期间心肌细胞凋亡的诱因，通过不同的信号转导通路，启动内部机制，影响基因表达的水平，破坏凋亡诱导基因和凋亡抑制基因之间的动态平衡，导致细胞凋亡。许多研究结果证明了吸入性麻醉药对心肌缺血再灌注的保护作用与调节细胞凋亡有关，但其与凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达之间的关系还不是很清楚。本实验结果发现，在七氟醚组Bcl-2表达明显强于IR组，而Bax表达则明显低于IR组，说明七氟醚预处理对缺血再灌注心肌能够上调Bcl-2基因的表达、下调Bax基因的表达。结果表明七氟醚对心肌保护作用，其中一个机制可能是通过调控凋亡相关的Bcl-2和Bax的表达来实现。

七氟醚预处理可调节Bcl-2及Bax基因的表达，但它对其他凋亡相关基因是否也有作用，以及相关的机制是什么，这还需要更全面、更深入的研究。

参考文献

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