红花黄色素对实验性肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

高　燕　袁爱军　陈　航　贾海红　袁鲁亮　王茹欣

【摘要】 目的 观察红花黄色素注射液对肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞凋亡的的影响，探讨其肾脏保护机制。方法 45只雄性SD大鼠，随机分为假手术组(A组)、单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction; UUO)组(B组)、UUO联合红花黄色素治疗组(C组)，各15只。C组红花黄色素5 mg/(kg•d)，造模术前1 d开始腹腔注射给药，各组术后10 d处死大鼠，处死后取术侧肾组织行HE、Masson染色，TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡。结果 B组、C组可见明显肾间质纤维化的病理改变，可检测到凋亡细胞。C组与B组相比，肾间质纤维化病变程度较轻，凋亡细胞明显减少(P<0.01)。结论 注射用红花黄色素对大鼠肾间质纤维化有保护作用，这种作用可能通过抑制肾小管细胞过度凋亡实现。

【关键词】红花黄色素；肾间质纤维化；肾小管上皮细胞；凋亡

Effect of safflow yellow injection on apoptosis ofRenal tubular cells In rats with renal interstitial fibrosis

GAO Yan，YUAN Ai-jun，CHEN Hang，et al.The Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding，Hebei 071000,China

【Abstract】 Objective To observe the effect and mechanism of Safflow Yellow (SY) on apoptosis of renal tubular cells in rats with renal interstitial fibrosis.Methods 45 Male Sprague-Dawley rats were randomly divide into 3 groups:sham-operated group(A)，the UUO model group(B) and the treatment group treated with Safflow Yellow injection(C).Safflow Yellow injection 5 mg/(kg•d) was administered to rats 1 day before to 9 day after the surgery.Kidney were harvest at day 10.Histological changes were also observed by HE and Masson stain.Apoptosis of renal tubular cells was detected by terminal deoxynucleotidy 1 transferasemediated dUTP nick endlabeling assay(TUNEL).Results Markedrenal interstitial fibrosis changes were found in group B and group C.the lesion area in kidneys of group C significantly decreased compared with that of group B(P<0.01).apoptosis cells in renal tubular were significantly increased in the obstructed kidney and reduced by Safflow Yellow injection treatment(P<0.01).Conclusion Safflow Yellow could ameliorate renal interstitial fibrosis in rats，which might be realized by reducing renal tubular cell apoptosis.

【Key words】Safflow yellow;Renal interstitial fibrosis ;Tubular epithelial cells;Apoptosis

红花黄色素是红花中多种水溶性有效成分的混合物，属查尔酮类有效部位群。多年来，研究发现其具有扩张冠状动脉、抗血栓、抗动脉粥样硬化、降血脂、耐缺氧等药理作用而应用于心脑血管疾病。但有关红花黄色素对肾脏病变的研究报道较少，且缺乏相应的动物实验证据。研究证明，肾小管上皮细胞的凋亡、转分化及分泌细胞外基质等均参与了肾间质纤维化的过程。本实验通过UUO建立大鼠肾间质纤维化模型，观察红花黄色素注射液对肾小管上皮细胞凋亡的影响，探讨其肾脏保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁健康雄性SD大鼠45只(购自河北医科大学动物实验中心)体质量180~220 g。大鼠适应性饲养1周，随机分为：假手术组(A组)，UUO组(B组)，UUO联合红花黄色素治疗组(C组)各15只。

1.2 动物模型制备 大鼠经2%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧固定在手术台上，腹部皮肤消毒，铺无菌手术巾。左侧腹肾区切口2 cm，切开腹壁各层，进入腹腔。在左腹壁辨认输尿管后，分离输尿管，于肾盏处和肾下级处分别结扎输尿管，但并不离断输尿管，使左侧完全梗阻后逐层缝合腹壁切口。假手术组开腹后不结扎输尿管，然后缝合腹腔作为对照［1］。

1.3 给药方法 C组在术前1 d开始给予红花黄色素注射液［浙江永宁药业股份有限公司，5 mg/(kg•d)］，放于适量生理盐水中腹腔注射至术后第９天，A组及B组予等量生理盐水腹腔注射。实验期间大鼠自由进食水。

1.4 标本收集及制备 术后第10天断头处死大鼠，处死后切取左肾，冠状位剖开，置于4%多聚甲醛固定12 h，制备石蜡切片。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 肾小管间质的病理改变 石蜡切片行HE、MASSON染色，光镜下观察肾小管间质病变程度，测量皮质相对间质容积值。

1.5.2 肾小管上皮细胞凋亡检测(原位细胞死亡检测试剂盒购自北京中山生物有限公司)。

1.5.3 方法

1.5.3.1 肾组织病理检查 HE染色：切片常规脱蜡至水。苏木精染色1 min，自来水冲洗。1%盐酸分化，自来水冲洗。伊红染色2 min。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。MASSON染色：切片常规脱蜡至水。切片置于丽春红染液2 min。切片入2%冰醋酸水溶液2 min。5%磷钼酸水溶液媒染2 min。2%冰醋酸水溶液2 min。甲基绿染色3 min，自来水冲洗。95%乙醇分色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察其病理改变。

1.5.3.2 肾小管上皮细胞凋亡检测 TUNEL实验步骤：切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡入水。滴加蛋白酶Ｋ、3%H₂O₂室温孵育阻断内源性过氧化物酶，滴加反应混合溶液20 μl (TdT 2 μl，荧光素连接的核苷酸混合缓冲液18 μl)在湿盒中37℃孵育60 min。切片滴加1:2稀释的转化剂POD(HRP连结的抗荧光素抗体)20 μl，在湿盒中37℃孵育30 min，进行免疫反应，扩大信号。DAB H₂O₂显色。苏木精复染。梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片。

1.5.4 图象分析、结果判定

1.5.4.1 肾皮质相对间质容积及肾皮质相对胶原含量 采用真彩色病理图像分析系统(北航 4.0)，Masson染色切片在高倍镜(×200)下随机选择10个不含肾小球及血管的肾皮质视野，以肾间质面积占一个视野场面积的百分比，作为相对间质容积值。Masson染色绿色为胶原纤维，测定绿色胶原面积占一个视野面积的百分比，作为肾皮质相对胶原含量。

1.5.4.2 肾小管上皮细胞凋亡检测 阴性对照片为省去TUNEL反应液。光镜下分析结果。凋亡细胞胞核呈棕黄色颗粒沉着，应用真彩色病理图像分析系统计算结果，每张切片随机选取10个不含肾小球和小血管的肾皮质视野(×400)，计算每个视野凋亡阳性细胞总个数占统计场总面积的百分比(数密度)。

1.6 统计学方法 所有数据应用 SPSS 10.0统计软件处理。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾小管间质的病理改变 肉眼观察，A组肾脏组织红润，无肿大，B、C组梗阻侧肾脏体积明显增大，颜色变白，肾皮质变薄。HE染色可见A组肾脏病理未见改变。B组肾小管扩张明显，间质中大量单核与淋巴细胞浸润。C组与B组相比肾小管扩张、间质增宽程度、间质炎性细胞浸润程度有显著降低(P<0.01)。Masson染色可见A组大鼠肾脏胶原染色主要位于肾小球基底膜、Bowman囊、系膜区和肾小管间的毛细血管周围，而小管周围间质部分比较狭窄，B组胶原沉积明显增加，C组与B组相比胶原沉积的程度有显著降低(P<0.01)。

2.2 肾小管上皮细胞凋亡检测 A组未检测到明显的肾小管凋亡细胞。B组梗阻侧肾脏可检测到较多的凋亡细胞，C组与B组相比肾小管上皮细胞凋亡显著降低(P<0.01)。见表2。

3 讨论

红花黄色素是从红花中提取的有效成分，属水溶性黄酮中查尔酮类物质，研究发现其具有扩张冠状动脉、抗血栓、抗动脉粥样硬化、降血脂、耐缺氧等药理作用而应用心脑血管病的治疗［2，3］。但有关红花黄色素对肾脏病变的研究报道较少，且缺乏相应的动物实验证据。本实验通过UUO建立大鼠肾间质纤维化模型，观察红花黄色素对肾小管上皮细胞凋亡的影响，旨在探讨红花黄色素对肾间质纤维化的作用机制。

UUO是研究进行性小管间质纤维化成熟的实验模型。在本研究中，观察到梗阻后大鼠的肾脏体积增大，肾皮质变薄，肾间质炎细胞浸润，肾小管扩张、坏死，肾间质面积增宽，胶原成分增加，间质纤维化病变突出。提示该模型的建立成功［4，5］。

研究结果表明，肾脏疾病时肾小管上皮细胞增殖与凋亡之间的不平衡，可能是导致肾小管萎缩和肾功能恶化的机制之一，虽然以往从组织形态学和肾功能影响方面对输尿管梗阻引起的肾细胞凋亡进行阐述，但从分子水平上研究甚少。TUNEL法是一种分子生物学与免疫组织化学相结合原位检测凋亡细胞DNA片段的方法，因其灵敏可靠而被广泛用于细胞凋亡的研究。本实验使用TUNEL法观察到UUO组肾皮质小管上皮细胞凋亡数量明显增加。与黄凌虹等［6］的报道一致。大量肾小管细胞凋亡导致肾小管局部环境破坏，这可能是触发间质细胞过度增殖，并最终形成纤维化的重要因素，因此，阻止肾小管细胞过度凋亡，保护肾小管周围环境，可起到预防间质纤维化的作用。本实验观察到红花黄色素治疗组与UUO组相比，肾小管细胞凋亡情况明显改善，提示红花黄色素可通过减少肾小管细胞过度凋亡，保护肾小管周围环境来实现延缓肾间质纤维化的作用。

参考文献

［1］ 刘克剑，张悦，李靖，等.单侧输尿管梗阻法制作大鼠肾间质纤维化模型的改进.中国实验动物学报，2007，6(15):410-412.

［2］ 朴永哲，金铭，臧宝霞，等.红花黄色素缓解心肌缺血作用机制的研究.中华老年心脑血管病杂志，2002，4(1)：67.

［3］ 金鸣，高子淳，王继峰.羟基红花黄色素A抑制PAF诱发的家兔血小板活化的研究.北京中医药大学学报，2004，27(5)：32-35.

［4］ Klahr S，Morrissey.Obstructive nephropathy and renal fibrosis.Am J Physiol Renal Physiol，2002，283(5):861-875.

［5］ Liu Y.Renal fibrosis:new insights into the pathogenesis and therapeutics.Kidney Int，2006，69(2):213-217.

［6］ 黄凌虹，张国强，叶任高，等.细胞增殖与凋亡在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化发病中的意义.中华肾脏病杂志，2000，16(1):24-27.