肾缺血再灌注损伤中氧自由基和钙超载的作用

车吉忠 李晨光 张大田

[摘要] 引起肾缺血再灌注损伤的因素主要有氧自由基生成增多、钙超载、能量代谢障碍、血管内皮细胞功能障碍、细胞凋亡及粒细胞浸润等,本文就氧自由基、钙超载在肾缺血再灌注损伤中的作用和两者关系作一综述。

[关键词] 肾;缺血再灌注损伤;氧自由基;钙超载

[中图分类号] R334+.1[文献标识码] A[文章编号] 1004-8650(2009)05-127-03

肾脏的缺血再灌注在临床上较常见,如肾移植、肾损伤、休克、肾实质切开取石、肾部分切除、肾血管性高血压的手术治疗、胸腹主动脉瘤手术、体外肾脏等。肾脏是一个高灌流的器官,在缺血及再灌注的过程中不可避免会受到伤害,这种损害被称为缺血再灌注损伤(IRI)。他是Jennings等于1960年首先提出的,是指组织器官缺血后再灌注,不仅不能使组织器官功能恢复,反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤。IRI在许多重要器官均可发生,是临床上最常见的病理生理变化。引起IRI的相关因素很多,下面就氧自由基、钙(Ca2+)超载在肾缺血再灌注损伤中的作用和两者关系作一综述,以供临床和实验中肾保护研究作一参考。

1氧自由基(OFR)与肾缺血再灌注损伤

由氧诱发的自由基称为氧自由基,其主要包括:羟基自由基(OH-)和超氧阴离子自由基(O2·-)。正常生理状态下,体内能产生少量氧自由基,约占机体总氧耗量的5%。由于机体内具有灭活氧自由基的酶系统使正常情况下产生的氧自由基迅速消除,不产生损伤作用。当组织细胞缺血、缺氧时,氧自由基清除系统功能降低或丧失,而生成系统却活性增强,一旦恢复血流供应和氧供,氧自由基便大量产生与急剧“堆积”,以不同方式造成细胞急性或慢性损伤[1]。

1.1氧自由基的生成

氧自由基的来源主要有两个方面, 一是电离辐射、某些药物、酒精、吸烟或高压氧中毒等,这些称外源性自由基;二是机体在代谢过程中产生自由基,即内源性自由基。在肾脏缺血再灌注过程中,氧自由基主要来源于内源性自由基,其生成主要有3个途径: (1)黄嘌呤氧化酶途径。(2)线粒体呼吸链途径。缺血后的血管内皮细胞是氧自由基的主要来源,而在内皮细胞中,线粒体又是氧自由基产生的主要部位。研究证实,活性氧是线粒体在生理和病理条件下产生的[2]。(3)白细胞途径。肾脏缺血再灌注时大量聚集在缺血区的白细胞被激活,氧耗量迅速增加,这时的O2经白细胞的还原型辅酶II的作用,产生超氧阴离子,后者经一系列化学反应,产生有细胞毒性的过氧化氢、羟自由基等。

1.2氧自由基引起肾缺血再灌注损伤的机制

正常的线粒体有内膜和外膜两层膜结构,两层膜中间为膜间腔,内膜内侧为基质。线粒体外膜通透性较高,内膜对各种物质的通过性有严格的选择性,几乎所有的离子和不带电荷的小分子化合物都不能自由的通过。由于线粒体内膜对离子通透性的严格限制,结果使基质内充满了高选择性的分子。电化学梯度的存在是维持线粒体产生ATP的基础,氧化剂和抗氧化剂形成的稳定平衡是一些生物过程所必须的,如维持Ca2+循环、酶的活性、信号转导途径和基因转录的调节[3]。生理条件下,每分子O2在复合体Ⅳ的水平被4个电子还原(四价还原),但仍然有约2%-4%的氧只能得到单个的从电子传递链上复合体漏出的电子(单价还原),形成活性氧(ROS)。这种少量产生ROS是保持氧化还原状态所必须的,对基因的活性,Ca2+循环以及维持许多酶的功能非常重要。缺血期肾脏的血流阻断使细胞供氧明显减少,从而导致细胞低氧和氧化磷酸化抑制,细胞内ATP浓度快速下降。为了保持线粒体完整性,线粒体内的ATP合酶水解ATP以保持线粒体跨膜电位[4]。ATP水解导致游离的磷酸盐升高,促使内膜通透性增加,缺血时间延长导致位于复合体Ⅰ和复合体Ⅱ中的铁硫蛋白的退化,引起二价铁离子的释放,在再灌注期参与ROS的形成[5]。线粒体呼吸链复合体Ⅰ和复合体Ⅱ是产生ROS的主要因素,氧化呼吸链的阻断可导致肾脏细胞损伤和细胞凋亡。

氧自由基能使肾组织细胞生物膜的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化,生成脂质过氧化物(LPO),LPO分解时产生的丙二醛能使DNA、蛋白质发生交联。当DNA的双股螺旋同时被交联,细胞分裂时双股螺旋无法解开,导致细胞死亡,蛋白质被交联后形成无定形的沉淀物。由于蛋白质被破坏,一些酶活性降低,影响细胞代谢。细胞膜的脂质过氧化可引起膜通透性增强,线粒体膨胀,溶酶体酶的释放,酶的失活等损伤,从而导致细胞膜的结构和功能改变,出现细胞的变性和坏死。Castedo等[6]在动物实验中发现,再灌注后细胞内膜脂质过氧化增强,形成多种生物活性物质,如血栓素、前列腺素等,促进再灌注损伤。此外,氧自由基还可作用于细胞膜上的寡糖链中糖分子的羟基碳,使之氧化成为不饱和碳基或二聚体,引起细胞的多糖链破坏,造成细胞自溶。

近年的研究揭示, 核转录因子NF-κB的活化参与了缺血/再灌注性肾损伤[7]。NF-κB是氧化还原作用敏感的转录因子,它调控着多种细胞因子、生长因子和化学趋化因子的表达[8] 如,TNF- 、TNF-β、白细胞介素(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-11、IL-12、IL-17),细胞趋化因子(IL-8、MIP-1、MCP-1、RANTES),一氧化氮合成酶(iNOS)及粘附分子(ICAM-1,VCAM-1,E-seletin,P-seletin)。静息状态下NF-κB多以P50和P65二聚体与其抑制蛋白IκB相结合而存在于胞浆中,呈无活性状态。当受到外源性刺激如脂多糖、缺血再灌注、TNF-α等激活时,IκB迅速磷酸化而与NF-κB解离。活化的NF-κB从胞浆进入细胞核,在核内与多种基因启动子特异性序列结合,并启动转录发挥其调控作用[8]。NF-κB是调控诸多基因的转录因子,参与多种基因特别是与炎症及免疫反应相关基因的表达调控,其中包括炎性细胞因子等。孙艳玲等研究发现肾缺血再灌注后NF-κB大量活化,活化的NF-κB通过调控细胞因子和黏附分子的表达而参与了肾缺血再灌注损伤的发生发展[9]。氧自由基可激活NF-κB,促进炎性介质的表达,进而引起细胞损害。

此外,氧自由基的大量产生和堆积可以诱导肾脏细胞的凋亡,其途径主要为:①直接损伤线粒体,释放细胞色素C,激活同型半胱氨酸蛋白酶,诱导细胞凋亡[10]。②破坏抑癌基因P53和HIF-1α,引起细胞凋亡[11]。③攻击蛋白质、脂质和核酸,以及由此产生的毒性产物,消弱细胞的生存能力,从而诱导细胞的凋亡[12]。④激活内源性核酸内切酶、酪氨酸激酶、蛋白激酶C,诱导细胞发生凋亡[13,14]。

2Ca2+超载与肾缺血再灌注损伤

1972年Shen和Jennings发现犬心脏冠状动脉短暂闭塞后复灌可加速细胞内Ca2+的积聚,并首次提出钙超载之说。维持细胞内外Ca2+梯度相对稳定的机制是:受体依赖性钙通道、电压依赖性钙通道(VDAC通道)、内质网和线粒体、肌浆网对钙的调节、Ca2+泵、Na+-Ca2+交换体、钙调蛋白等。破坏以上任何一个机制均会引起细胞内外钙的重新分布,进而造成一系列的损伤。

钙超载引起肾细胞受损,其机制主要有以下几个方面:① 线粒体功能障碍。线粒体通过多种钙转运机制,从内膜摄取和释放钙,调节细胞内局部和整个细胞的钙离子浓度。在细胞内钙超载时,线粒体的Ca2+转运器(MCU)摄取细胞内钙。当线粒体对钙的摄取量达到一定程度时,引起线粒体通透性转运孔(PTP)的开放。PTP是近年来发现的,他是一种位于线粒体膜上的复合物,结构非常复杂,研究发现,他含有CyP-D,也可能包括肌酸酐激酶,线粒体外膜蛋白或VDAC通道以及己糖激酶。PTP开放时许多大分子非选择性地由胞浆向线粒体扩散,导致线粒体膜电位的破坏和功能障碍,细胞内钙超载时,Ca2+也可与PTP相结合,导致线粒体肿胀,功能失调,均能引起细胞死亡[15]。② 酶的激活。细胞内钙超载时,Ca2+ 激活Ca2+依赖的磷脂酶A2和钙敏感性蛋白酶C,磷脂酶A2和蛋白激酶C的活化可导致花生四烯酸形成,花生四烯酸不仅通过其清洁剂样性能干扰细胞膜,他还是环氧化酶的重要底物。花生四烯酸的活化可导致前列腺素和血栓素A的形成,而前列腺素是OFR产生的底物。磷脂酶C催化磷酸肌醇水解能产生三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG),前者可动员细胞内Ca2+,后者能激活蛋白激酶C,间接地通过Ca2+通道和Na+-H+交换加剧Ca2+超载[16]。激活的钙蛋白酶能促使作为细胞骨架成分的胞衬蛋白裂解,在Ca2+的刺激下,核支架蛋白酶使分离核中的纤层蛋白降解,从而直接损伤细胞[17]。钙蛋白酶是各种细胞毒物质造成细胞死亡的重要中介,用线粒体抑制剂抗霉素A作用于近端肾小管细胞时,钙蛋白酶活性增加并引起外钙内流,接着钙蛋白酶从胞质中转移到细胞上,从而引起Cl-内流和细胞溶解死亡。钙蛋白酶的激活在细胞损伤过程中发挥双重作用。起始的钙蛋白酶激活导致胞外Ca2+经硝苯地平敏感的钙通道内流,接着转移到胞膜上,引起Cl-内流和细胞死亡[18]。③Na+-K+ ATP酶活性受到抑制。缺血期肾脏血流减少甚至完全阻断使细胞供氧明显减少,从而导致细胞低氧和氧化磷酸化抑制,细胞内ATP浓度快速下降和ADP短暂的升高,大量的磷酸链堆积,细胞通过促进糖酵解以维持细胞内ATP浓度。因糖酵解产生乳酸使细胞pH下降。缺血持续时ATP浓度的下降使Na+-K+ ATP酶活性受到抑制,胞浆Na+浓度进行性增加,伴细胞外K+浓度增加。胞内Na+激活Na+-Ca2+交换和Na+-H+交换使胞内Ca2+和H+浓度的升高。细胞内Na+升高也导致细胞膜去极化引起短暂的电压依赖型Ca2+通道开放,Ca2+内流增加。此外,有人提出,细胞内Ca2+的增多可能是细胞粘附蛋白介导中性粒细胞(PMN)释放的磷脂酶及氧自由基对细胞膜结构及肌浆网Ca2+泵功能破坏的结果,因而认为Ca2+负荷过重是氧自由基及PMN作用机制的一部分[19]。

3氧自由基与Ca2+超载关系

再灌注时,钙离子交换受阻,导致线粒体及溶酶体内Ca2+浓度升高,Ca2+与胞浆受体钙调蛋白结合后,激活蛋白酶和磷酯酶A,引起膜磷脂水解(其过程伴随有OFR的产生),游离脂肪酸释放,使细胞膜和线粒体膜的结构和骨架破坏,线粒体肿胀导致氧化-磷酸化脱偶联,使能量代谢发生障碍。蛋白酶的激活,使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶(XO),而XO无法氧化次黄嘌呤,导致其大量堆积。在再灌注状态下,大量分子氧在XO催化下促进堆积的次黄嘌呤分解,伴随形成大量的OFR,而肾脏内的SOD、CAT等氧自由基清除剂因为缺血缺氧抑制了其活性,不能有效地清除OFR,以致OFR的大量堆积。过量的Ca2+还可以激活中性粒细胞,引起其“代谢爆发”,产生大量OFR。钙超载与氧自由基的产生是肾缺血再灌注损伤的重要因素,二者相互影响,协同作用,导致肾缺血再灌注损伤加重。OFR使脂质发生过氧化反应,改变膜通透性,促进新的Ca2+内流,同时OFR破坏线粒体结构,干扰氧化磷酸化过程,加速ATP等高能磷酸化合物的耗竭,使ATP依赖的离子泵活性下降,其结果也促进了细胞内Ca2+的增加[20]。

综上所述,氧自由基、Ca2+超载引起肾缺血再灌注损伤的机制是极其复杂的,两者相互联系,协同作用,形成恶性循环,最终导致肾细胞不可逆损伤。此外,肾缺血再灌注损伤本身是一个由多个因素、多个途径、多个方面所介导的复杂过程,目前具体机制尚未清楚,相信随着分子生物学技术对缺血再灌注损伤的深入研究,人们会逐渐了解肾脏缺血再灌注损伤的发生机制,为临床治疗指明方向。

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(收稿日期2009-02-05)