脑缺血再灌注损伤中钙超载相关通路研究进展

李传朋 高 颖,2 高永红,2 蒋 萍 董兴鲁,2

1.北京中医药大学东直门医院脑病科，北京 100700；2.北京中医药大学中医脑病研究院，北京 100700

中风是目前造成患者致残率和致死率较高的主要原因之一。我国中风患病率为873.4/10 万，死亡率为149.49/10 万[1]。其主要类型为缺血性中风，研究发现在缺血性中风的病理过程中，即使血流恢复了，病情也并不能减轻，反而会进一步加重缺血半暗带的损伤，这个病理过程称之为“脑缺血再灌注损伤”，它是急性缺血性中风的核心病理环节，也是目前研究的热点问题[2]。在脑缺血再灌注中，缺血的组织在恢复血供后会使细胞内Ca2+含量明显增加，从而引起细胞损伤的现象称为钙超载。研究显示，细胞内钙超载是中风后脑缺血再灌注损伤的关键病理因素[3]，同时也是许多有害因素导致神经元死亡的共同通路[4]，但钙超载在脑缺血再灌注损伤的上下游病理机制仍需进一步梳理。因此，结合近年来国内外对缺血性中风脑缺血再灌注过程中钙超载机制的研究进行综述，以进一步阐明钙超载上下游的病理机制途径，以期为研发抗钙超载中风治疗的新药提供参考。

1 介导钙超载的机制

1.1 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体与钙超载

NMDA 受体是一种Ca2+双重门控系统，大量分布在神经元突触后膜[5]。研究显示，缺血性中风后神经系统的损伤与NMDA 受体密切相关[6]，谷氨酸受体过度激活引起的神经元死亡是由细胞内钙浓度升高介导的。一方面，缺血性中风发生后，去极化引起的神经元和胶质细胞大量释放谷氨酸，这些谷氨酸大量聚集在神经细胞突触部位，与NMDA 受体结合，激活NMDA 受体，造成Ca2+通道打开，Ca2+大量涌入，导致神经细胞钙超载。有研究将嗜铬细胞瘤细胞暴露于谷氨酸，观察到细胞内Ca2+含量增加，使用药物抑制谷氨酸的释放可显著降低细胞内Ca2+含量，减少细胞死亡，证实了谷氨酸诱导细胞损伤的作用与Ca2+内流有关[7]。Park 等[8]在研究槲皮素治疗对谷氨酸诱导的神经细胞损伤中海马钙蛋白表达的调节作用时，发现谷氨酸兴奋毒性显著增加海马细胞内钙浓度，而槲皮素可以减轻钙超载。另一方面，NMDA 受体包括许多亚型，N-methyl-D-aspartate（NMDA）-R2A subunit（NR2A）与N-methyl-D-aspartate（NMDA）-R2B subunit（NR2B）是NMDA 受体介导Ca2+通道关闭与开放的两个最主要的亚基，其中NR2B 是主要的磷酸化调控区域[9]。在缺血再灌注过程中，细胞周期蛋白依赖性激酶5（cyclin-dependent kinase-5，CDK5）可与NR2B 相互作用并使NR2B 磷酸化，即在NR2B 加入一个磷酸基团，进而影响NMDA 受体的活性，造成NMDA 受体通道的开放率增加，促进大量Ca2+内流，导致钙超载的发生[10]。Zhou 等[11]通过一种膜渗透性肽（Tat-CDK5-CTM）特异性破坏CDK5 和NR2B 的结合，然后通过溶酶体介导的途径导致CDK5 降解。发现Tat-CDK5-CTM 的使用可以抑制氧和葡萄糖剥夺处理的神经元中的钙超载，结果表明CDK5 通过磷酸化NR2B 参与了钙超载的发生。

1.2 瞬时受体电位通道2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）与钙超载

TRPM2 属于瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道家族的一员，是由细胞内ADP-核糖（adenosine diphosphate ribose，ADPR）门控形成的非选择性Ca2+通道[12]。TRPM2 通道是介导细胞内Ca2+稳态改变的关键机制，TRPM2 通道活性的异常在细胞凋亡中起重要作用，从而破坏各种细胞功能[13]。TRPM2蛋白由胞质N 和C 末端调节域组成，N 末端包含4 个TRPM 通道家族同源成员和1 个位于残基404～416的钙调蛋白结合基序。TRPM2 在C 端跨膜结构域具有TRP 区段，分为两个区域：第二可变区和卷曲螺旋结构域。在TRPM2 的C 末端，盘绕的基序与特定的亚基相互作用，并将TRPM2 组装成功能性四聚体形式。TRPM2 的C 末端还含有核苷二磷酸连接的X 型同源基序包括11 个残基的ADPR 结合口袋。ADPR是一种调节Ca2+内流的新型第二信使，并且可以直接打开TRPM2[14]。脑缺血再灌注发生后活性氧（reactive oxygen species，ROS）的升高导致poly-ADPR 聚合酶、poly-ADPR 糖水解酶和DNA 损伤。然后，poly-ADPR聚合酶和poly-ADPR 糖水解酶将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为ADPR 单体以激活TRPM2，促进Ca2+内流，进而导致钙超载的发生。有研究通过降低TRPM2的表达，观察到细胞内钙浓度的降低，并且降低了雄性小鼠海马神经元的损伤，证实了TRPM2 在介导Ca2+的作用[15]。同时，通过敲低TRPM2，培养的神经元细胞死亡明显减少。表明TRPM2 促进缺血诱导的神经细胞死亡，而通过使用靶向TRPM2 的RNA 抑制剂TRPM2 siRNA 处理显著抑制了细胞Ca2+流入和神经元细胞死亡[16]。

1.3 酸敏感离子通道（acid sensitive ion channels，ASICs）与钙超载

ASICs 属于表皮钠通道的一种，它是H+门控型阳离子通道，在细胞外H+浓度增高时被激活开放[17]。ASICs 包含六种亚基，其中一个亚基ASIC1a 在大脑中广泛表达，对酸离子十分敏感，是导致酸中毒的主要因素，当受到酸离子刺激时，其对Ca2+保持较高的通透性，触发Ca2+超载，进而导致缺血性损伤后神经元损伤的加重[18]。缺血性中风发生后，血流阻断和ATP 耗竭引起厌氧糖酵解的代偿反应，以提供短暂的能量支持，但导致了乳酸和H+浓度增加[19]。当进行无氧的糖酵解时，脑缺血缺氧极易激活对酸的敏感性，打开对ASIC1a 钙通透的同聚体通道引起细胞外钙内流[20]。同时，ASIC1a 膜受体和离子通道的激活也受到pH 值的影响，在脑缺血再灌注期间，氧供应不足致使脑组织进行无氧的糖酵解，产物乳酸和ATP水解产物的积聚致缺血性组织周围的pH 值显著下降，严重脑缺血时可导致缺血区组织周围的pH 值明显降到6.0，缺血缺氧组织酸化时，ASIC1a通道开放，大量Ca2+内流，进而导致钙超载[21]。此外，Ca2+成像技术也显示酸中毒可通过ASIC1a 诱导Ca2+进入，并且以谷氨酸受体非依赖性方式促进细胞质Ca2+升高。在培养的皮层神经元中，ASIC1a 激活及其介导的Ca2+进入参与酸中毒诱导的神经元损伤，而ASICs 阻滞剂的应用可显著降低这种损伤[22]。

1.4 ATP 供应不足影响钠/钙交换器（Na+/Ca2+exchanger，NCX）介导钙超载

ATP 供应充足是细胞钙稳态的重要条件，而血流通畅又为维持细胞能量稳态提供了重要保障。当缺血性中风发生后，血流的减少导致ATP 的产生大量减少，细胞膜电势能减弱，造成神经元和胶质细胞去极化，激活Ca2+通道，引发了细胞内的钙超载[23]。在这个过程中，NCX 扮演着重要的角色。NCX 是一种双向离子交换转换器，在生理情况下，它可利用Na+的浓度梯度泵入3 个Na+排除1 个Ca2+。而当能量产生发生障碍时，NCX 的能量供应受到影响，排除Na+的工作停止，细胞内Na+浓度升高。NCX 工作方式发生转向，即变成泵出3 个Na+泵入1 个Ca2+。前一种生理情况下称之为“前向模式”，后一种称之为“反向模式”[24]。NCX 有三种亚型，分别为NCX1、NCX2、NCX3，NCX1在诱导脑缺血/再灌注过程中引起钙超载起重要作用。基于使用NCX 抑制剂的实验发现，NCX 反向模式是体内脑缺血-再灌注过程中出现钙超载的重要诱因[25]。研究表明，当ATP 水平足够时，激活NCX1的前向模式，NCX1 将Na+泵入细胞并从细胞内泵出Ca2+。而在缺血性再灌注过程中，组织处于缺血缺氧状态，ATP 的产生大量减少，激活了NCX1 的反向模式，从而导致细胞内钙超载的发生[26]。另一项研究表明，NCX 可增加钠瞬变，钠流入驱动NCX 逆转，引发大量二次钙升高，同时促进钠的输出，导致离子梯度的破坏，并最终导致了钙超载[27]。除此之外，通过内源性钙蛋白酶抑制剂的慢病毒递送抑制NCX3 的切割可以阻止与神经元死亡相关的继发性钙超载。通过表达功能性NCX2 也可阻止钙超载的发生，从而证实了NCX 通过Ca2+的泵入参与钙超载的发生[28]。

1.5 高尔基体Ca2+-ATPase（secretory pathway Ca2+-ATPase，SPCA）与钙超载

SPCA 是定位于高尔基体上的Ca2+泵，分泌型SPCA参与高尔基体Ca2+的释放和吸收，对脑缺血再灌注过程中钙超载的发生发挥了重要作用。高尔基体膜泡中浓度的变化趋势与细胞质浓度变化趋势正好相反。在缺血和再灌注早期高尔基体膜泡浓度下降迅速，而细胞内Ca2+浓度迅速上升，高尔基体SPCA 通过泵出高尔基体储存的Ca2+造成了细胞内的钙超载[29]。Li 等[30]以4 只血管闭塞大鼠为模型，检测大鼠大脑皮层神经细胞胞质和高尔基体囊泡中SPCA1 的表达和Ca2+浓度的研究表明，高尔基体小泡中Ca2+含量的变化与缺血和再灌注过程中的Ca2+浓度相反。在缺血和早期再灌注过程中，高尔基体小泡急剧下降表明高尔基体参与了建立过程通过唯一的钙通道肌醇1，4，5-三磷酸受体途径使细胞质发生钙超载。而再灌注后期，高尔基体囊泡中的Ca2+浓度迅速恢复，显示高尔基体可以“缓解”钙超载的情况。研究表明高尔基体应激对脑缺血和再灌注反应可通过重塑细胞质Ca2+的稳态来实现。

1.6 钙调蛋白（calmodulin，CaM）介导钙超载

CaM 是一种多功能的中间信使蛋白，它通过结合Ca2+来转换钙信号[31]。研究显示，在大鼠脑缺血再灌注损伤模型中，缺血再灌注组脑内CaM 活性水平升高[32]。CaM 可通过影响L-型Ca2+电压门控钙通道的开放，调节兴奋-收缩偶联中Ca2+进入细胞的过程，进而介导钙超载的发生，引起破坏性脑功能障碍[33]。Yuan 等[34]研究发现，血浆CaM 水平与急性缺血性卒中引起的神经功能缺损的严重程度密切相关，发现CaM 通过介导L-型Ca2+电压门控钙通道的开放信号，促进钙内流引起了钙超载。

2 钙超载介导损伤的机制

2.1 导致神经元线粒体裂变和线粒体损伤

缺血性中风可导致线粒体功能障碍。在这个过程中，钙超载神经元的胞质Ca2+升高造成大量Ca2+进入线粒体，超过线粒体所能承受的钙阈值，导致线粒体钙超载，进而造成线粒体损伤、线粒体通透性转换以及促凋亡蛋白的释放[35]。在中风后几小时内一些恢复刺激前Ca2+水平的神经元细胞依然会在之后的时间出现死亡迹象，这种延迟死亡现象是由钙超载致线粒体损伤造成的，受损的线粒体启动细胞凋亡样死亡信号，引发了延迟性细胞死亡[36]。Pivovarova 等[37]为了研究线粒体钙超载与细胞脆弱性之间的联系，检验只有钙超载损伤的线粒体亚群释放凋亡因子的假设，测量了单个线粒体中总Ca2+的浓度，发现延迟死亡的神经元是由于钙超载导致线粒体亚群释放凋亡因子，而其他未受损的线粒体维持正常功能。Hu 等[38]研究发现，脑缺血再灌注损伤期间线粒体的变化涉及缺血性再灌注诱导线粒体的过度活化，线粒体功能障碍和延迟的神经元死亡。这是由于细胞内钙超载刺激了线粒体通透性转换的持续开放，导致线粒体损伤。

2.2 导致氧化应激

钙超载激活Ca2+依赖性分解代谢酶，作为第二信使触发下游信号途径的级联事件，伴随着Ca2+依赖性酶的激活，这些酶上调ROS 的生成，诱导氧化应激，抑制呼吸链酶的活性，并促进ROS 介导的信号调节[39]。钙超载也会导致氧化还原调节的多聚蛋白复合物的开放，促进凋亡蛋白的释放，从而引发死亡级联反应。在这些过程中，由过量ROS 产生引起的氧化应激在脑损伤中起主要作用[40]。Ca2+流入产生的ROS 包括超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟基自由基、一氧化氮和过氧亚硝酸盐，由于ROS 的产生，加剧了氧化应激反应[41]。在缺血早期钙流入启动下游炎症和凋亡介质，发生解耦并产生许多ROS，导致了广泛的氧化应激。ROS 样自由基通过细胞器膜过氧化破坏脂质、蛋白质和DNA，并导致细胞内细胞器破坏，诱导了细胞凋亡[42]。

2.3 激活内质网应激

内质网是真核细胞内参与分泌蛋白及膜蛋白正确折叠与分泌的重要细胞器，内环境的稳定是实现其功能的基本条件[43]。虽然内质网具有极强的内稳态体系，但在急性缺血性中风发病过程中，病灶区域脑组织因血供不足处于缺血缺氧状态。此时病灶组织中自由基含量明显增加，影响内质网膜上的Ca2+泵功能，从而逐步耗竭内质网内的Ca2+，引起细胞内Ca2+超载，钙超载可通过钙依赖性蛋白酶引起内质网应激，刺激细胞凋亡。在这个过程中，钙蛋白酶通过靶向钙调节蛋白导致钙从内质网释放。内质网中Ca2+的长期耗竭会损害蛋白质的加工[44]。导致内质网的内稳态失衡，内质网未折叠的蛋白质会明显增多，当超出内质网处理能力时，细胞会激活相关信号级联反应，启动未折叠蛋白反应来应对条件的变化和恢复内质网良好的蛋白质折叠环境，即内质网应激[45]。但随着刺激的持续存在，会激活由其介导的凋亡通路，发生细胞凋亡。当内质网功能严重受损时，内质网钙储存的持续受损再摄取又会加剧细胞内钙超载，促进μ-钙蛋白酶的自溶。因此，内质网和钙超载之间就形成了恶性循环[46]。

3 讨论

脑血管疾病是目前危害人类健康的疾病之一，在以缺血性中风为代表的脑血管疾病中，脑缺血再灌注损伤占据着核心病理环节的位置。而钙超载是缺血性再灌注损伤许多通路的共同环节，基于钙超载的病理网络寻找干预途径具有十分重要的科学意义。在钙超载的上游网络中，目前的研究主要集中在谷氨酸兴奋毒性、TRPM2、NCX、ASICs，然而在高尔基体、CaM 致钙超载的过程还有待深入研究。在下游，钙超载可通过氧化应激、线粒体损伤、内质网应激诱导细胞凋亡，可见细胞凋亡是再灌注损伤许多通路的终末结果，如何在细胞启动程序化死亡之前，针对上下游的各条网络通路进行干预，进而大范围降低细胞凋亡的数量从而减轻缺血性再灌注损伤，是今后一个时期缺血性中风临床干预的一个重要研究方向。因此，基于钙超载上下游的网状机制来探索寻找抗脑血管病干预机制具有广阔的前景和重要的意义，为缺血性中风新药研发提供了重要的方向。