过量氟诱导成釉细胞钙超载及细胞凋亡的实验研究

张颖　马林　李健　等

[摘要] 目的 研究过量氟对体外培养大鼠成釉细胞内钙超载及细胞凋亡的影响。方法 取大鼠成釉细胞系HAT-7细胞，分别加入不同浓度（0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mmol·L-1）的氟化钠培养液，培养48 h后，采用Cell Counting Kit 8（CCK-8）试剂盒检测各组细胞的活性，流式细胞术分析氟对细胞凋亡的影响，激光扫描共聚焦显微镜、Western blot试验和实时荧光定量聚合酶链反应技术检测过量氟诱导大鼠成釉细胞内Ca2+浓度和钙网蛋白表达的变化。结果 氟化钠浓度高于1.6 mmol·L-1时，可抑制成釉细胞的活性，成釉细胞内Ca2+浓度升高，钙网蛋白表达上调，细胞早期凋亡数量增加，并且随着浓度的增加，细胞凋亡的数量也随之增加。结论 过量氟可引起成釉细胞内钙超载，诱导成釉细胞凋亡。

[关键词] 氟； 成釉细胞； 钙超载； 钙网蛋白； 细胞凋亡

[中图分类号] R 780.2 [文献标志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.003

氟是一种具有防龋功能的微量元素，但在牙齿的发育矿化时期，若机体摄入过量的氟会引起一种特殊的釉质发育不全，称为氟牙症。氟牙症的发病机制还未完全明确。有学者认为，地方性慢性氟中毒性疾病属于“钙矛盾”疾病[1]，即整个机体缺钙，但细胞内Ca2+增多。Ca2+参与和调控多种细胞和组织的生理活动，包括肌肉收缩、新陈代谢以及细胞分裂等[2-3]。但是，若细胞内Ca2+浓度过高，可引起细胞凋亡，导致一些疾病的发生[4-5]。成釉细胞是釉质形成的关键，过量氟摄入机体，是否会导致成釉细胞Ca2+内流增加，产生钙超载，诱导成釉细胞凋亡，目前还少有研究。本实验应用不同浓度的氟化钠作用于体外培养的成釉细胞系HAT-7细胞，观察氟化钠对成釉细胞内Ca2+的影响，检测细胞凋亡的变化，为进一步研究氟牙症的发病机制提供依据。

3 讨论

釉质的发育过程是复杂并受到精确调节的动态过程[6]。成釉细胞负责调控釉质有机基质的合成、分泌和移除，同时也与钙盐的活跃转运有关。在本实验中，高浓度的氟化钠（1.6、3.2、6.4 mmol·L-1）培养HAT-7细胞48 h，成釉细胞开始凋亡，显著降低了细胞的活性。有研究[7]表明，氟化钠（100 ng·mL-1）可促进细胞膜Ca2+通道在短时间内（20 s）迅速开放，使人成骨细胞内Ca2+浓度迅速增高。在本实验中，经不同浓度氟化钠作用48 h后，HAT-7细胞内Ca2+浓度明显增加，并且Ca2+浓度增加与氟化钠浓度呈正相关。Ca2+是细胞内的主要信使之一，在维持细胞的正常结构和功能方面起重要作用[8]。当一些有害因素引起钙平衡系统功能失调时，Ca2+分布紊乱，细胞内Ca2+浓度异常性升高，即为钙超载，此时可引起细胞凋亡[9-10]。本研究结果提示，过量的氟可以引起HAT-7细胞发生钙超载，从而诱导细胞发生凋亡。

CRT是一种类凝集素蛋白，也是主要的Ca2+结合蛋白，可以通过调节自身Ca2+结合能力和肌浆网Ca2+泵的活性而调节Ca2+稳态[11]。目前对CRT在细胞凋亡中的作用尚存在争议。有学者[12]认为，过度表达的CRT引起细胞质内Ca2+反应性增强，诱导Ca2+依赖性蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2A，PP2A）的表达和活性均上调，使蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）去磷酸化，抑制PKB信号转导途径，使细胞对凋亡刺激的敏感性增加。有学者[13-14]应用大鼠心肌细胞进行研究，证明CRT过表达可促进内质网Ca2+释放及细胞外Ca2+内流，从而加重细胞质Ca2+超载，增加细胞对应激致凋亡的敏感性。与上述研究结论相反，Hung等[15]发现CRT过表达可以减轻H2O2对肾小管上皮细胞的损伤。本研究发现，0.8 mmol·L-1氟化钠培养HAT-7细胞48 h后，可促进细胞的增殖，CRT mRNA表达量升高；当氟化钠浓度为1.2 mmol·L-1时，CRT mRNA表达量最高；氟化钠浓度为1.6 mmol·L-1时，细胞发生早期凋亡。通过CRT的作用机制，笔者猜想，当CRT少量过表达时，可增加内质网Ca2+的缓冲能力和/或抑制过多Ca2+对细胞的毒性作用，发挥保护细胞的作用；但当CRT过表达时间过长或过多时，其保护细胞的作用将消失，转而诱导细胞的凋亡。同时本研究通过Western blot试验也发现，当氟化钠浓度为1.2、1.6 mmol·L-1时，CRT表达量增高，但氟化钠浓度为0.8 mmol·L-1时，CRT表达量与对照组没有明显差异，分析原因可能是由于在mRNA转录、修饰蛋白质的过程中，细胞内也发生其他蛋白质的调控，导致蛋白质合成的量与mRNA固有的量不相匹配。

综上所述，氟对成釉细胞的影响与氟浓度有关，过量的氟可通过诱导细胞发生Ca2+超载介导细胞凋亡。在Ca2+超载早期，CRT起到保护细胞的作用；当Ca2+超载过于严重或持续时间过长，CRT则会诱导细胞凋亡。

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（本文采编 王晴）