兔面神经外伤性损伤后恢复的实验研究

沈晨 郭智霖 欧阳火牛

兔面神经外伤性损伤后恢复的实验研究

沈晨 郭智霖 欧阳火牛

目的通过比较兔压榨性损伤组与正常组的面神经功能与组织学差异，研究面神经的损伤及其修复过程，为临床治疗周围性面瘫寻找合适的干预时机。方法15只普通级成年新西兰兔，分别对其左侧颞外面神经主干施以压榨性损伤，分别于损伤后2周、4周、6周取材，通过电生理测定、显微结构观测及相应的组织学量化分析等方法，比较实验组与对照组间的差异。结果损伤后2周时，大部分轴突颗粒状变性，髓鞘松解；4周时，部分轴突恢复正常；6周后，压迫组基本恢复正常结构，其电生理功能与形态学相符。损伤4周后，总体轴突密度为68.88%；6周后，总体轴突密度恢复至88.63%，与正常组比较均有统计学差异。结论兔面神经损伤2周后部分神经功能开始恢复，至6周时功能基本恢复。

家兔损伤面神经功能修复

随着交通事故等的快速增多，外伤导致的周围性面瘫逐渐成为较常见的临床疾患。由于显微神经修复技术的广泛运用，治疗完全性面神经损伤已经获得长足的进展。然而，对于不完全性面神经损伤，大部分仍是通过药物进行治疗，这些保守治疗方法的发展有赖于新药的开发和促进神经再生方法的不断进步[1]。

本实验通过对家兔面神经压榨性部分性损伤后的电生理检测和组织学观察，比较损伤面神经和正常面神经之间的差别，研究兔外伤性面神经损伤后的自我修复过程，为临床部分性面神经损伤患者的治疗方式选择和治疗时机选择提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

15只普通级成年新西兰兔（上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心提供），体重平均2 kg，雌雄不限。分为正常组（n=15）和实验组（n=5）。

1.2 损伤模型的建立

动物用氯胺酮（0.1 mg/kg）肌肉麻醉，加局部浸润麻醉（5%利多卡因）。动物俯卧位，按照外科神经探查路径解剖，游离颞外面神经主干后，使用血管阻断夹在面神经从茎乳孔潜出部近端0.2 cm的位置造成压迫性损伤（血管阻断夹在面神经上持续施压60 min，相当于Sunderland’sⅡ级损伤）。然后，逐层关闭术区。术后每只动物肌肉注射庆大霉素8万单位，动物单笼、常规饲养。

1.3 电生理检测

电生理检测采用Medelec Synergy T2生理记录仪（Oxford instruments公司）。根据标记暴露面神经总干损伤部位周围约10 cm，将刺激电极与神经干近心端充分接触，将记录电极插入口轮匝肌，两极距离为10 cm。刺激方式为方波刺激，波宽1 ms，测定口轮匝肌复合动作电位的最大波幅和潜伏期。

1.4 组织学观察

术后2周、4周、6周时取材行组织学观察。1%低聚甲醛固定，并用0.1 mol/L磷酸钠缓冲调pH值至7.3。取出神经段为损伤处远端并向下延伸0.5 cm。尼康Eclipse E 600（Nikon公司）显微镜观察、拍照，使用Sigma Scan Pro 5.0软件(Sigma公司)计数。

定性分析包括大体神经结构、组织成分和再髓鞘化程度。定量分析包括损伤神经远端有髓神经纤维数量和正常面神经有髓神经纤维数量。

1.5 统计分析

数据以（均值±标准差）表示，使用t检验法和方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 电生理检测

损伤后2周时，实验组未诱导出复合动作电位，4周、6周时实验组均可诱导出口轮匝肌复合动作电位，复合动作电位的最大波幅及峰值潜伏时间随观察时间的延长，逐渐接近正常组（表1）。

表1 口轮匝肌复合动作电位最大波幅和潜伏期

2.2 组织学观察

正常神经由1～5条神经束被纺锤形细胞组成的神经外膜包绕。轴突排列规则且直径相似，髓鞘密集，无退变；雪旺细胞分布规则，核的大小及形状近似；神经束膜为一层疏松结缔组织（图1）。

压榨性损伤2周后，损伤神经的外膜和束膜增厚，有髓轴突显著减少（大多数停留在髓鞘化初级阶段），髓鞘极薄而且神经直径纤细。间质稀薄且有少量胶原纤维，还有一些新生血管出现（图2）。

4周后，损伤神经出现更多的有髓轴突，髓鞘化程度明显增加，有不规则形状和大小的轴突出现，轴突直径增大，髓鞘厚度更厚；同时雪旺细胞增多，胞核小而稠密；神经外膜和神经束膜较正常组厚（图3）。

损伤6周后，神经轴突细胞器和胶原纤维明显增多，轴突直径增粗，髓鞘进一步增厚，形成更多的均一轴突；血管数减少，神经外膜变薄，成纤维细胞和雪旺细胞数量减少（图4）。

2.3 组织学定量分析

损伤2周后，由于轴突数量太少，难以准确测量，因此被排除在分析范围之外。

损伤后4周时的总轴突数和神经横断面总面积与正常组有显著性差异(P＜0.05)；6周时与正常组无显著性差异(P＞0.05)。损伤后4周时，轴突密度为68.88%，6周时为88.63%，与正常组比较有统计学差异。

图1 正常面神经(尼氏染色，50×)

图2 面神经压榨性损伤后2周(尼氏染色，100×)

图3 面神经压榨性损伤后4周(尼氏染色，50×)

图4 面神经压榨性损伤后6周(尼氏染色，50×)

3 讨论

目前，仅有一种标准化的实验模型用于研究外周神经损伤，即大鼠的坐骨神经损伤模型[2-3]。但对于面神经的研究则没有公认的标准化模型。面神经是具有运动和感觉功能的混合神经，对于损伤的反应与其他外周神经并不完全相同[4-8]，没有确切的方法可用于量化评估面神经的修复。

Vasconcelos等[8]的研究发现，在兔面神经损伤模型中尼氏染色法可用来明确神经元轴突数，而且可获得较为精确的神经元恢复数据；相比而言，小鼠则表现为非典型的损伤后轴突反应，不利于量化评估面神经的修复[9-10]。另外，兔的面神经解剖特征也与人类更为近似[11]。

选择面神经主干为受损区，是由于面神经在此处很少有解剖变异[6]，而且也更接近神经元胞体，可增大再生率[12]，能更简易地评估神经功能情况。

电生理检测是评价神经功能的重要指标[13-14]。本实验通过测定兔面神动作电位最大波幅和潜伏期来量化恢复水平。本实验中，面神经运动功能的恢复出现在损伤后的4周内，与文献资料相符[5，10]。

1998年，Cai等[1]建立了压榨性损伤方法，可用于建立Sunderland’sⅡ级损伤模型。分析计数有髓轴突的数量被许多学者认为是研究神经再生的较为客观的方法[6-7]。但是，大多数研究只是着眼于连续区域的神经轴突数或总轴突数，而缺乏轴突密度的测量与比较[5，8]。本实验中，我们联合了以上方法和量化分析，获得了再生神经的量化数据。

我们通过对细胞结构的连续观察，发现间接损伤主要造成轴突的肿胀、髓鞘的板层解离及脱失、胶质细胞增生、毛细血管破裂出血等改变，且在损伤后1～2周最为显著。第4周时，部分轴突及髓鞘出现修复迹象，6周时已有明显修复，轴突变性坏死后留下的空隙已由胶质纤维充填。

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[8]Vasconcelos BCE,Gay-Escoda C.Facialnerve repair with expanded plytetrafluoroethylene and collagen conduits:an experimental study in the rabbit[J].J Oral Maxillofac Surg,2000,58(11):1257-1262.

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Experimental Study on Compression Facial Nerve Injury in Rabbits

SHEN Chen,GUO Zhilin,OUYANG Huoniu.
Department of Neurology Surgery,The Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:GUO Zhilin.

ObjectiveTo study posttraumatic regeneration of the facial nerve in rabbits.Functional and histological analysis were compared with normal nerves on opposite sides to finding the suitable opportunity to treat the peripheral facial paralysis on clinic.MethodsThe left facial nerve trunks of 15 rabbits were selected to compression lesion and the right sides of them serve as the control groups.The rabbits were killed at 2,4 and 6 weeks after the operation,respectively.The obtained specimens were observed macroscopically,microscopically and electrophysiologically.ResultsQualitative analysis demonstrated a degenerative pattern with an increased tissue inflammatory process in the rabbits at 2 weeks after the operation.Electrophysiological evident regeneration signs were observed and almost complete regeneration was seen at 4 and 6 weeks after operation,respectively.The total density(TD)of nerve of the experimental 68.88%and 88.63%at 4 weeks and 6 weeks after the operation,respectively;showing statistically significant differences between experimental and control groups.ConclusionThe partial facial nerve function could recover at 2 weeks of compression lesion.The most nerve function could recover at 6 weeks of compression lesion.Normal nerves showed a significant higher partial density than injured nerves.However,Nerve total density was a more reliable index than partial density in this study.

Rabbits;Injury;Facial nerve;Function;Regeneration

R651.3

A

1673－0364（2009）03－0150－03

2009年3月22日；

2009年5月10日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.009

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院神经外科。

郭智霖。