间歇低氧训练活性氧介导基因调控作用的研究

黄丽英　翁锡全　林　文

摘要：目的：试图从活性氧（ROS）角度出发，探讨间歇低氧训练对低氧敏感基因及相关基因表达调节作用的机制,为运动与低氧适应提供理论依据。方法：采用二氯荧光素双醋酸盐（DCFH睤A）荧光探针观察线粒体ROS的变化，利用RT睵CR技术研究心肌组织低氧诱导因子1(（HIF1α）、原癌基因（c瞗os）、MnSOD和肾脏组织EPO基因的mRNA表达水平的变化。结果：低氧应激后ROS产生增多，经过4周的间歇低氧训练适应后再低氧应激， ROS的产生减少；低氧应激后 HIF1α、EPO、c瞗os、MnSOD基因表达增加，间歇低氧训练适应后这些基因指标较常氧组呈显著性上升（p<0.05）。结论：ROS作为低氧应激和运动应激的靶点之一引起细胞氧化应激，其产生又能激活核因子HIF1α，使一些相关低氧敏感基因EPO、MnSOD、c瞗os的转录发生变化，促使其转录及mRNA表达增强。这些基因指标的变化规律与ROS的变化相吻合，表明HIF1α、EPO、c瞗os、MnSOD基因的表达与低氧适应有密切关系。

关键词：间歇低氧训练；大鼠；活性氧；基因调控

中图分类号：G804.21文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)05-0615-03

活性氧（ROS）作为细胞毒素的作用已被人们基本认可。除了其负面的损伤作用，ROS也积极参与对细胞信号转导的调控。大量研究证明，ROS参与许多重要的生命过程，如细胞增殖与分化、细胞凋亡、肿瘤的诱发与抑制、肌肉收缩、神经传导、细胞吸附、基因表达等均与ROS有着密切的关系。在间歇低氧训练中ROS的产生是否也充当第二信号分子介导基因表达呢？它又是如何介导基因调控的呢？这方面尚未见有文献报导，本文实验试图从ROS角度出发，探讨间歇低氧训练对低氧敏感基因及相关基因表达调节作用的机制,为运动与低氧适应提供理论依据。

1材料和方法

1.1动物模型8周龄雄性SD大鼠70只，随机分为7组，分别为：1） 常氧安静组；2） 常氧训练组；3） 急性低氧安静组；4） 急性低氧运动组；5） 急性低氧训练组；6） 间歇低氧安静组和；7） 间歇低氧训练组，每组大鼠10只。6、7组每天20:00-次日8:00居住在常压低氧舱中（14.5%含氧量，采用的设备为美国Hypoxicon公司制造），共12 h，其余时间在舱外常氧中训练或自由活动，训练组（2）、（5）、（7）每天在舱外于动物跑台以25 m/min运动、1 h/d、5 d/周，共4周。（3-7）组采样前进行12 h低氧应激，（4）组低氧应激前进行1 h25 m/min运动。饲料由中山大学医学院动物实验中心提供，饮水为净化自来水，自由摄食、饮水，环境温度及光照时间正常。

1.2研究方法

1.2.1线粒体活性氧(ROS)的测定(DCFH-DA法)［4］

1.2.2基因表达RT-PCR一步法。

1.2.2.1RT-PCR试剂美国Invitrogen公司SuperScript One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase。

1.2.2.2引物下面引物设计采用OMIGA2.0软件,在gene bank 中可查到。

1.2.2.3反应条件48℃ 25 min；94℃2 min；94℃ 15sec；55℃ 30sec；72℃ 1 min；32个循环；72℃延伸7 min。

1.2.2.4结果计算和统计处理凝胶电泳结束后用凝胶成像系统拍照并进行电泳条带光密度分析。标本靶基因条带光密度参数与内参基因（GAPDH）条带的光密度参数之比值作为该标本mRNA的表达水平参数，在WINDOWS FOR SPSS11.0软件上进行统计，采用独立样本玊检验，以平均数±标准差(Means±SD)来表示。

2结果

2.1低氧应激对大鼠心肌线粒体ROS的影响

由表1可知，急性低氧应激后，心肌ROS呈上升趋势。与常氧安静组相比，急性低氧安静组（组3）均显著升高（玴<0．05），急性低氧运动组（组4）均呈极显著升高（p<0.01）；与常氧训练组相比，组4均呈极显著升高（p<0.01）；与急性低氧运动组相比，组5和组7均显著下降（p<0.05）。

2.2低氧应激对大鼠各基因 mRNA表达的影响

2.2.1低氧应激对大鼠心肌HIF-1α mRNA表达的影响从图1可见，与常氧安静组比较，各组HIF-1α mRNA表达水平上调，且急性低氧训练组有极显著性差异（玴<0.01），除常氧训练组外，其它各组之间均有显著性差异（玴<0.05）。

2.2.2低氧应激对大鼠肾脏EPO mRNA表达的影响从图2可见，与常氧安静组比较，急性低氧安静组和间歇低氧训练组都有显著性差异（玴<0.05），急性低氧运动组有极显著上升（p<0.01）；与常氧训练组相比，急性低氧运动组呈显著性上升（p<0.05）；与急性低氧训练组相比，急性低氧运动组上调明显（p<0.05）。

2.2.3低氧应激对大鼠心肌转录因子c-fos基因表达的影响从图3可见，与常氧安静组比较，除常氧训练组外，其余各组c-fos mRNA表达水平上调均显著（玴<0.05），且急性低氧运动组、急性低氧安静组和间歇低氧训练组均有极显著性差异（p<0.01）；与常氧训练组相比，急性低氧运动组极有显著上升（p<0.01），间歇低氧训练组有显著性增加（p<0.05）；与急性低氧训练组相比，急性低氧运动组上调明显（p<0．05）。

2.2.4低氧应激对大鼠心肌MnSOD mRNA表达的影响从图4可见，与常氧安静组比较，急性低氧运动组和间歇低氧训练组均有显著性升高（玴<0.05）；与急性低氧训练组相比，急性低氧运动组上调明显（p<0.05）。

3讨论

线粒体是氧代谢的主要部位,是氧感受和信号转导途径之一。Chandel等［5］实验结果发现低氧时ROS产生增加,本文实验发现低氧应激线粒体ROS产生增加,急性低氧应激与一次性急性运动负荷后，线粒体ROS剧增，可见这是由于低氧应激产生的ROS与运动产生的ROS叠加的结果。段春礼等实验结果证明ROS的适应性参与缺氧耐受性的形成,本实验观察到大鼠经过4周的低氧适应后再急性低氧应激，心肌线粒体ROS的产生较一次急性低氧应激少，同时我们还发现经低氧与运动训练适应后较单纯低氧适应效果好。

ROS过多对细胞产生毒害作用,引起脂质过氧化、DNA损伤、蛋白质交联和-SH基氧化。ROS作为信号分子,在细胞氧浓度变化与有关转录因子结构与功能的反应性变化之间,提供一种化学连接，这种信号传递的最佳方式是对蛋白质-SH基氧化还原的调制。其中氧还态的化学调制包括NF-(B、c-fos以及HIF-1等许多重要的转录因子。O2.-经Fenton反应形成活性氧中间体，可使HIF-1的—SH氧化为—SS而影响HIF-1活性，导致蛋白质的巯基由氧化型向还原型转变，促使决定HIF-1活性的亚基HIF-1α与HIF-1β形成二聚体,激活其结合DNA的活性。活化的HIF-1参与对其它分子转录的调控,从而启动了细胞的低氧反应基因系统，使一些相关低氧敏感基因的转录发生变化，促使一些基因的转录及表达增强。本实验观察到低氧应激能使HIF-1(基因表达水平上升，与文献报导一致［6］。Halterman认为中度缺氧可使HIF-1α复合物稳定,引起应答基因表达。本实验观察到间歇低氧训练持续4wk后HIF-1α mRNA的表达增加，可能是适度的低氧反复刺激和运动训练的适应，使HIF-1α 基因产生了适应。HIF-1可能直接受ROS的调控，低氧时HIF-1α蛋白水平和HIF-1DNA结合活性增加，调节许多低氧反应基因的表达，成为细胞氧平衡和低氧反应基因表达的一个中心调节因子。低氧时HIF-1α蛋白水平增加、入核、二聚化，结合于低氧反应基因中的低氧反应元件上的HIF-1结合位点，促进低氧氧敏感基因的转录。HIF-1调控的主要靶基因有：EPO、MnSOD、c-fos等。低氧调节EPO基因表达是一个十分复杂的过程,涉及EPO基因上许多顺式调节元件以及其上特异结合的反式作用因子，低氧主要是通过提高HIF-1α的转录活性和稳定性,促进HIF-1α与EPO基因3增强子中的Site 1相结合,调节EPO基因表达。本实验观察到间歇低氧训练组EPO mRNA表达水平显著性升高（玃<0.05），这与文献报导一致。Macaya等实验结果表明脑在缺血再灌过程中ROS增加，诱导c-fos、c-Jun mRNA 基因表达［3］。Russell等报导肺在缺氧后MnSOD活性和MnSOD mRNA的表达减少；转基因鼠在低氧条件下较正常鼠MnSOD mRNA表达量高［7］。本实验观察到急性低氧使抗氧化酶基因表达增加，这可能是机体代偿性升高，机体自我保护的现象。张敏等研究表明，大鼠在低压氧环境下进行反复短暂的高强度运动，心肌CuZnSOD mRNA的表达增高，认为是心脏适应性的变化。我们发现经过4wk的间歇低氧适应后机体抗氧化酶MnSOD mRNA表达整体水平提高，间歇低氧运训练效果更明显，表明经过低氧与运动训练的适应能提高机体抗氧系统的能力，有效清除低氧时ROS的产生，使机体得到保护。以上基因的表达与低氧适应有密切关系。HIF-1作为基因转录的生理调节因子,是对低氧适应的重要中介因子,是与红细胞生成、血红蛋白增加、血管生长、血流供应、氧化和能量代谢相关基因转录和表达密切相关的一个重要调节因子。

综上所述，低氧应激ROS产生可使HIF-1α基因表达增加，使一些相关低氧敏感基因EPO、MnSOD、c-fos的转录发生变化，促使其转录及mRNA表达增强。HIF-1可能直接受ROS的调控。ROS作为低氧应激和运动应激的靶点之一引起细胞氧化应激，其产生又能激活核因子HIF-1，从而诱导EPO、MnSOD等抗氧化酶基因的表达，可见间歇低氧训练中ROS充当第二信号分子介导基因表达。这些基因指标的变化规律与ROS的变化相吻合，表明HIF-1α、EPO、c-fos、MnSOD基因的表达与低氧适应有密切关系。低氧环境条件下ROS产生增加，使机体产生氧化应激，由于ROS通过信号传导通路激活转录因子基因的转录,通过它再诱发应答靶基因的较高水平转录和表达,导致一系列抗氧化酶及DNA修复酶活性增强和其它蛋白质的变化,从而提高低氧的适应能力。

参考文献：

［1］ Sethi S, Singh MP, Dikshit M. Mechanisms involved in the augmentation of arachidonic acid-induced free-radical generation from rat neutrophils following hypoxia-reoxygenation. Thromb Res，2000，98(5):445-50.

［2］ Sasaki H, Ray PS, Zhu et al. Hypoxia/reoxygenation promotes myocardial angiogenesis via an NF kappa B-dependent mechanism in a rat model of chronic myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol，2001，33(2):283-94.

［3］ Macaya A，Munell F, Reventos Jet al. Molecular factors of cerebral hypoxia-ischemia .Rev Neurol，1996，24(131):855-64.

［4］ Bejma J, Ji LL. Aging and acute exercise enhance free radical generation in rat skeletal muscle. J Appl Physiol，1999，87(1):465-70.

［5］ Chandel E, Maltepe E, Goldwasser. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia-induced transcription. Cell Biology，1998，95(20):11715-11720.

［6］ Halterman MW, Federoff HJ. HIF-1alpha and p53 promote hypoxia-induced delayed neuronal death in models of CNS ischemia ［J］.Experi Neurol,1999(1),159:65-72.

［7］ Suzuki M, Takeuchi H, Kakita T.The involvement of the intracellular superoxide production system in hepatic ischemia-reperfusion injury. In vivo and in vitro experiments using transgenic mice manifesting excessive CuZn-SOD activity. Free Radic Biol Med，2000，29(8):756-63.