婴幼儿食品中有益菌功能及安全性分析

摘 要：目的：从市售婴幼儿食品中分离筛选益生菌并分析其功能特性和安全性。方法：对30份市售婴幼儿食品进行益生菌分离鉴定，结合体外培养和动物实验，分析分离菌株的存活率、功能特性及安全性。结果：从30份市售婴幼儿食品中分离鉴定出4株优势菌株，包括2株植物乳杆菌（LP-01、LP-02）和2株乳双歧杆菌（BL-01、BL-02）。其中以LP-01菌株表现最佳，在4 ℃条件下储存6个月的存活率最高；在人工胃液中3 h存活率为85.2%±2.1%；抑菌圈直径为（15.2±0.8）mm，表现出良好的耐受性和抗菌性。同时，添加LP-01可显著提高小鼠肠道屏障功能。安全性实验表明，LP-01在1010 CFU·kg-1 bw的剂量下，无不良健康效应；除LP-02对四环素和BL-01对红霉素表现出耐药性外，其他菌株对所测试的8种抗生素均敏感，且未检出任何可转移抗性基因。结论：本研究可为建立益生菌安全评估体系和质量控制标准，以及益生菌在婴幼儿食品中的应用提供科学依据。

关键词：婴幼儿食品；益生菌；功能特性；安全性；质量控制

Functional and Safety Analysis of Beneficial Bacteria in Infant and Toddler Food

DU Feifei

（Chongqing Inspection Biotechnology Co.， Ltd.， Chongqing 401121， China）

Abstract： Objective： To isolate and screen probiotics from commercially available infant and toddler food， and analyze their functional characteristics and safety. Method： Probiotics were isolated and identified from 30 commercially available infant and toddler foods. Combined with in vitro culture and animal experiments， the survival rate， functional characteristics， and safety of the isolated strains were analyzed. Result： Four dominant bacterial strains were isolated and identified from 30 commercially available infant and toddler foods， including two strains of Lactobacillus plantarum （LP-01， LP-02） and two strains of Bifidobacterium lactis （BL-01， BL-02）. Among them， the LP-01 strain showed the best performance， with the highest survival rate after 6 months of storage at 4 ℃; the survival rate in artificial gastric juice for 3 hours was 85.2%±2.1%; the diameter of the antibacterial zone is （15.2±0.8） mm， indicating good tolerance and antibacterial activity. Meanwhile， "adding LP-01 can significantly improve the intestinal barrier function of mice. Safety experiments have shown that LP-01 has no adverse health effects at a dose of

1010 CFU·kg-1 bw; except for LP-02 showing resistance to tetracycline and BL-01 showing resistance to erythromycin， all other strains were sensitive to the 8 tested antibiotics and no transferable resistance genes were detected. Conclusion： This study can provide scientific basis for establishing a probiotic safety assessment system and quality control standards， as well as the application of probiotics in infant and toddler food.

Keywords： infant and toddler food; probiotics; functional characteristics; security; quality control

随着人们对婴幼儿营养和健康的日益关注，益生菌婴幼儿食品逐渐成为市场热点。益生菌能够调节肠道菌群平衡，增强免疫力，对婴幼儿的健康成长具有重要作用。然而，在食品中应用益生菌仍面临诸多挑战。田云等[1]研究表明，益生菌在加工和贮存过程中易受温度、pH值、水分活度等因素影响，导致存活率和功能活性显著降低；崔欣美等[2]指出，益生菌的功能稳定性受食品基质类型和加工工艺的影响较大。在安全性方面，陈潇等[3]研究发现，部分婴幼儿食品中可能存在潜在致病菌污染风险，而屈鹏峰等[4]进一步指出，我国婴幼儿食品益生菌的质量控制标准仍需完善。目前研究主要集中在益生菌对促进婴幼儿健康的作用[5]，而对其在不同食品基质中的稳定性机制、安全性评估和质量控制的系统研究相对不足。因此，本文通过探讨婴幼儿食品中益生菌的功能特性和安全性，建立相应的质量管理体系，旨在为其合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料：30份市售婴幼儿食品（配方奶粉、米粉、果泥等）；乳酸菌、双歧杆菌和4种病原菌的标准菌株；Caco-2和RAW264.7细胞株。

实验动物：ICR小鼠、SD大鼠和SPF级BALB/c小鼠。

实验试剂：MRS培养基；TPY选择性培养基；革兰氏染色、DNA提取、PCR扩增和ELISA试剂盒；DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素双抗、胰酶消化液等细胞培养相关试剂。

1.2 仪器与设备

YQX-Ⅱ型厌氧培养箱，上海一恒科技有限公司；JSM-7800F扫描电镜，日本电子株式会社；Bio-Rad CFX96 PCR仪，美国伯乐公司；ABI 3730XL DNA测序仪，美国应用生物系统公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株分离

从30份市售婴幼儿食品（配方奶粉、米粉和果泥各10份）中分离益生菌。称取25 g样品加入

225 mL无菌生理盐水中均质，然后进行10倍系列稀释（10-1～10-6），将稀释后的样液分别涂布于MRS和TPY选择性培养基上，37 ℃厌氧培养48～72 h获得纯培养物。

1.3.2 菌株鉴定与分类

采用革兰氏染色，并用扫描电镜观察菌株形态，进行生理生化实验（触酶、氧化酶活性，4～37℃生长特性和2.0%～6.5% NaCl耐受性）及API 50CH分析。提取基因组DNA，并通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增16S rDNA，PCR反应程序为95 ℃预变性5 min、30个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s）、72 ℃终末延伸10 min，测序并进行BLAST数据库比对。

1.3.3 存活率研究

将1.3.2中筛选出的2株植物乳杆菌（LP-01、LP-02）和2株乳双歧杆菌（BL-01、BL-02）分别接种于经灭菌处理的婴幼儿食品中，在4、25、37 ℃条件下储存6个月，每月固定时间采样测定其活菌数。

1.3.4 耐受性评价

将LP-01、LP-02、BL-01和BL-02分别进行人工胃液（pH=3.0，处理3 h）和0.3%胆盐（处理4 h）处理，测定菌株存活率。

1.3.5 抗菌活性与免疫调节功能研究

采用牛津杯法测定4株益生菌菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。将金黄色葡萄球菌（1×106 CFU·mL-1）均匀涂布于LB琼脂平板，在平板上放置牛津杯，并分别加入4株益生菌菌株的菌液200 μL，37℃培养24 h后测量抑菌圈直径。将小鼠脾脏细胞与4株益生菌菌株共培养48 h后，检测细胞因子水平，分析吞噬能力和炎症因子表达。

1.3.6 肠道菌群研究

设置对照组（PBS缓冲溶液）、配方奶粉组（LP-01，109 CFU·mL-1）、米粉组（LP-01，109 CFU·mL-1）和果泥组（LP-01，109 CFU·mL-1）4组。每组随机分配8只BALB/c小鼠进行连续灌胃28 d后，测定结肠黏膜厚度、杯状细胞数量、紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1）的表达水平，同时检测血清中脂多糖和D-乳酸含量。

1.3.7 安全性评估

基于前期急性毒性试验（一次性给予

1010 CFU·mL-1的菌悬液，灌胃剂量10 mL·kg-1）结果确定剂量范围。采用LP-01菌株进行亚慢性毒性试验，将大鼠随机分为对照组（生理盐水）、低剂量组

（108 CFU·kg-1 bw）、中剂量组（109 CFU·kg-1 bw）和高剂量组（1010 CFU·kg-1 bw），连续灌胃90 d。采用电子天平测定大鼠体重；利用全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶（Glutamic Pyruvic Transaminase，ALT）和谷草转氨酶（Glutamic Oxaloacetic Transaminase，AST）活性；根据肝脏重量与体重的百分比计算肝脏系数。监测相关指标并建立质量控制体系。

1.3.8 抗生素耐药性分析

采用琼脂稀释法测定4株益生菌对8种抗生素的最小抑菌浓度。将益生菌悬液（106 CFU·mL-1）分别接种到含不同浓度抗生素的培养基中，37 ℃培养48 h。同时采用PCR技术检测抗性基因。

1.4 数据处理

使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理、绘图，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 菌株分离和鉴定结果分析

从30份市售婴幼儿食品中分离获得20株优势菌株，通过16S rDNA测序和生理生化特性分析，最终筛选出4株优势菌株，包括2株植物乳杆菌（LP-01、LP-02）和2株乳双歧杆菌（BL-01、BL-02）。

2.2 不同储存条件对益生菌存活率的影响

如图1所示，在不同温度条件下，4株益生菌存活率均随储存时间延长呈下降趋势。其中，LP-01在4 ℃条件下储存6个月的存活率最高；在37 ℃条件下，各菌株的存活率下降趋势明显，且储存3个月后，所有菌株存活率均不符合益生菌食品的质量标准，因此未继续监测4～6月的数据。

图1 不同温度条件下4株益生菌的存活率变化

2.3 益生菌的耐受性分析

由图2可知，4株益生菌在人工胃液（pH=3.0）中培养3 h后，LP-01的存活率最高，为85.2%±2.1%，其次是LP-02（82.5%±2.0%）和BL-01（81.3%±1.9%），BL-02的存活率最低，为79.8%±2.2%。在0.3%胆盐处理4 h后，LP-01菌株的存活率最高，为78.5%±2.3%，其次是LP-02（76.2%±2.0%）和BL-01（74.3%±1.9%），BL-02的存活率最低，为77.2%±2.4%。表明筛选的4株优势菌株具有良好的胃酸和胆盐耐受性。

2.4 益生菌的抗菌活性和免疫调节功能评价

由图3可知，4株益生菌株对金黄色葡萄球菌均表现出明显的抑制作用。其中，LP-01抑菌活性最强，抑菌圈直径为（15.2±0.8）mm，其次是LP-02，抑菌圈直径为（14.5±0.7）mm，而BL-01和BL-02的抑菌圈直径分别为（13.8±0.6）mm和（12.5±0.5）mm。

免疫调节功能测定结果见图4，4株益生菌与脾脏细胞共培养后均能诱导IL-2和IFN-γ的产生，其中LP-01诱导细胞因子表达水平最高，其次是LP-02。而BL-01和BL-02的诱导能力相对较弱。结果表明，所筛选的益生菌株具有较好的免疫调节功能，其中植物乳杆菌的免疫调节能力优于乳双歧杆菌。

2.5 益生菌对肠道屏障功能的影响

如图5所示，LP-01菌株能有效改善小鼠肠道屏障功能。以配方奶粉组为例，与对照组相比，在结构指标方面，结肠黏膜厚度从80%升高至100%，杯状细胞数量从80%升高至110%；在分子水平上，连接蛋白表达量由80%上升至140%；在屏障功能方面，血清脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）水平从80%降低至45%，D-乳酸水平从80%降低至45%。米粉组和果泥组也表现出类似的趋势，但效果不及配方奶粉组。

2.6 亚慢性毒性试验结果分析

由表1可知，各剂量组大鼠体重增长率、肝功能指标ALT和AST及肝脏系数与对照组均无显著差异（p＞0.05），表明LP-01在1010 CFU·kg-1 bw的剂量下，无不良健康效应，该菌株在这个剂量水平以下使用是安全的。

2.7 抗生素耐药性分析

如表2所示，LP-02对四环素（32 μg·mL-1）和BL-01对红霉素（64 μg·mL-1）表现出耐药性，其他菌株对所测试的8种抗生素均敏感。PCR检测结果显示未检出任何可转移抗性基因。

3 结论

本研究系统地探讨了婴幼儿食品中益生菌的功能特性和安全性。从不同食品基质中筛选出的乳酸菌和双歧杆菌菌株表现出良好的耐受性，具有显著的抗菌活性和免疫调节功能。动物实验验证，益生菌可增强肠道屏障功能。安全性评估显示筛选出的菌株无毒性，并据此建立完整的质量管理体系，为益生菌在婴幼儿食品中的应用提供参考。

参考文献

[1]田云，郝娟，马永轩.食品中益生菌的功能与安全性研究进展[J].现代食品科技，2024，40（8）：415-427.

[2]崔欣美，乌力吉德力根.益生菌及其食品中应用研究进展[J].赤峰学院学报（自然科学版），2023，39（2）：34-38.

[3]陈潇，杨舒然，刘继开，等.婴幼儿食品中肠杆菌科重点致病菌污染风险及对我国标准修订的启示[J].中国食品卫生杂志，2024，36（3）：346-354.

[4]屈鹏峰，刘爱东.我国婴幼儿辅助食品标准现状和存在问题及修订建议[J].中国食品卫生杂志，2024，36（1）：

68-72.

[5]洪青，刘振民，杭锋.益生菌/益生元对婴幼儿健康作用的研究进展[J].食品工业，2018，39（5）：296-299.