德昂酸茶乳酸菌发酵饮料的工艺优化及品质分析
2025-01-26朱绍先侯艳刘娅卢凤美杨卫星李国友肖蓉
摘要：该研究以德昂酸茶为原料，以植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌为发酵菌种制备德昂酸茶乳酸菌发酵饮料，利用单因素试验和Box-Behnken试验设计优化发酵工艺条件，并检测其理化指标和微生物指标。结果表明，德昂酸茶乳酸菌发酵饮料最佳发酵工艺条件为白砂糖添加量4%、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌接种菌液体积比1∶2、菌种接种量2.5%、37℃发酵12 h。在此优化发酵工艺条件下，德昂酸茶乳酸菌发酵饮料的感官评分为84.85分，pH值为4.01±0.01，总酸含量为（0.34±0.02）g/L，可溶性固形物含量为（4.00±0.01）%，总糖含量为（2.24±0.1）g/100 mL，茶多酚含量为（13.73±0.29）g/L，游离氨基酸含量为（36.30±0.13）mg/100 mL，微生物指标均符合国家标准GB 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》的要求。
关键词：德昂酸茶；发酵饮料；发酵工艺优化；品质分析
中图分类号：TS275.2 文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2025）01-0135-06
Process Optimization and Quality Analysis of Lactic Acid Bacteria Fermented Beverage with De'ang Sour Tea
ZHU Shao-xian1， HOU Yan2， LIU Ya1， LU Feng-mei3， YANG Wei-xing1， LI Guo-you1， XIAO Rong1*
（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2.College of Tea Science， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;3.Dehong Mangshi Defeng Tea Industry Co.， Ltd.， Dehong 678400， China）
Abstract： In this study， De'ang sour tea is used as the raw material and Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus are used as the fermentation strains to prepare lactic acid bacteria fermented beverage with De'ang sour tea. Single factor test and Box-Behnken test design are used to optimize the fermentation process conditions， and the physicochemical and microbiological indexes are detected. The results show that the optimal fermentation process conditions of lactic acid bacteria fermented beverage with De'ang sour tea are white granulated sugar addition amount of 4%， Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus inoculated bacterial solution volume ratio of 1∶2， inoculation amount of strains of 2.5%， fermented at 37℃ for 12 h. Under the optimized fermentation process conditions， the sensory score of lactic acid bacteria fermented beverage with De'ang sour tea is 84.85 points， pH value is 4.01±0.01， total acid content is （0.34±0.02） g/L， soluble solid content is （4.00±0.01）%， total sugar content is （2.24±0.1） g/100 mL， the content of tea polyphenols is （13.73±0.29） g/L， and the content of free amino acids is （36.30±0.13） mg/100 mL. The microbiological indexes are all in line with the requirements of the national standard GB 7101—2022 Food Safety National Standard for Beverage.
Key words： De'ang sour tea; fermented beverage; optimization of fermentation process; quality analysis
收稿日期：2024-06-18
基金项目：云南省科技重大专项（202002AA100005）；云南德凤茶业有限公司合作项目（KX141721）
作者简介：朱绍先（1997—），女，硕士，研究方向：农产品加工及贮藏工程。
*通信作者：肖蓉（1965—），女，教授，研究方向：食品科学与安全。
进入大健康时代，植物发酵制品风靡全球[1]，随着微生物发酵技术的广泛应用，乳酸菌发酵型饮料已成为饮料行业研究的热点[2]，如乳酸菌果蔬汁、乳酸菌奶茶、乳酸菌植物饮料等[3]，但市场上乳酸菌发酵茶饮料种类较少。乳酸菌发酵茶饮料既能改善茶饮料的风味[4]，又能通过微生物代谢增加许多生物活性成分[5-6]。刘佳奇等[4]以植物乳杆菌发酵红茶浸提液，开发的红茶饮料较发酵前品质明显提升。冯雪娜等[7]以植物乳杆菌发酵红茶茶汤，所得红茶饮料酸甜可口，香气怡人，营养成分丰富。邓成林等[8]以植物乳杆菌发酵绿茶浸提液，得到一款风味和口感稳定的绿茶发酵饮料。目前相关研究较多以红茶和绿茶为基质，而针对其他茶类的研究较少。
德昂酸茶是我国云南少数民族德昂族、布朗族的一种传统发酵茶，当地人称之为“湿茶”或“沽茶”[9]，味微酸而清香，口感清凉且回甜，故得名酸茶[10]。德昂酸茶富含119种挥发性物质和1 130种非挥发性物质[11]，具有提神醒脑、开胃消食[12-13]、抗肥胖[14]和防治非酒精性脂肪肝的作用[14]。酸茶作为一种特殊的民族发酵食品，其制作技艺已被列入联合国教科文组织人类非物质文化遗产代表作名录，逐渐成为研究的热点。目前，针对酸茶的研究主要集中在品质、微生物菌群和功效等方面，鲜见对德昂酸茶加工制品的报道。
本研究以德昂酸茶为原料，以植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌为发酵菌种，制备德昂酸茶乳酸菌发酵饮料，对其进行感官评价，并测定其理化指标和微生物指标，以期为德昂酸茶产品的开发利用提供新思路，为德昂酸茶饮料规模化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
德昂酸茶：云南德凤茶厂；白砂糖：市售；植物乳杆菌（LP）和嗜酸乳杆菌（LA）：云南农业大学食品科学技术学院；酒石酸钾钠、硫酸亚铁、茚三酮等（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2F标准型净化工作台 中国检测仪器商城；LRH-250智能生化培养箱 上海瀚宇生物科技有限公司；pH计 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 德昂酸茶乳酸菌发酵饮料工艺流程和操作要点
1.3.1.1 工艺流程
酸茶→粉碎→酸茶粉→浸提→抽滤→茶汤→加糖→灌装→灭菌→冷却→接种发酵→成品→4℃冷藏。
1.3.1.2 操作要点
粉碎：将酸茶粉碎后过30目筛。
浸提：料液比1∶200 （g/mL）、浸提温度45℃、浸提时间60 min。
抽滤：用10目滤纸抽滤，去除茶渣，得茶汤。
调配：在茶汤中加入4%白砂糖，搅拌均匀。
灭菌：将调配好的茶汤装入干净玻璃瓶中，在灭菌器中进行灭菌（85℃，30 min），杀灭其有害微生物，防止干扰后续发酵，冷却备用。
发酵：将活化后的植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌按接种菌液体积比1∶2、接种量2.5%接种于冷却至37℃左右的酸茶汤中，用封口膜密封后放入37℃恒温摇床中发酵12 h得到成品，于4℃冷藏。
1.3.2 试验设计
1.3.2.1 单因素试验
白砂糖添加量的确定：在菌种类型LP∶LA 1∶1、菌种接种量2.5%、发酵时间12 h、发酵温度37℃的条件下，研究白砂糖添加量（3%、3.5%、4%、4.5%、5%）对德昂酸茶乳酸菌发酵饮料感官品质和活菌数的影响。
菌种类型的确定：在白砂糖添加量4%、菌种接种量2.5%、发酵时间12 h、发酵温度37℃的条件下，研究菌种类型（LP、LP∶LA 1∶2、LP∶LA 1∶1、LP∶LA 2∶1、LA）对德昂酸茶乳酸菌发酵饮料感官品质和活菌数的影响。
菌种接种量的确定：在白砂糖添加量4%、菌种类型LP∶LA 1∶2、发酵时间12 h、发酵温度37℃的条件下，研究菌种接种量（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%）对德昂酸茶乳酸菌发酵饮料感官品质和活菌数的影响。
发酵时间的确定：在白砂糖添加量4%、菌种类型LP∶LA 1∶2、菌种接种量2.5%、发酵温度37℃的条件下，研究发酵时间（8，10，12，14，16 h）对德昂酸茶乳酸菌发酵饮料感官品质和活菌数的影响。
1.3.2.2 响应曲面优化试验
在单因素试验结果的基础上，采用Design-Expert V8.0.6中的Box-Behnken设计三因素三水平优化试验，以感官评分（Y）为响应值，以白砂糖添加量（A）、菌种接种量（B）和发酵时间（C）为影响因素，响应面试验设计因素与水平见表1。
1.3.3 分析检测
1.3.3.1 理化指标的测定
pH值的测定：采用pH计；总酸含量的测定：参考GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》；可溶性固形物含量的测定：参考文献[15]；总糖含量的测定：采用蒽酮-硫酸法[16]；茶多酚含量的测定：采用酒石酸亚铁比色法[17]；游离氨基酸总量的测定：采用茚三酮比色法[18]。
1.3.3.2 微生物指标的测定
乳酸菌、大肠菌群、霉菌和致病菌依次参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》、GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》、GB 29921—2021《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》进行检测。
1.3.3.3 感官评价
德昂酸茶乳酸菌发酵饮料感官评价小组由5名男生和5名女生组成，在评价前进行专业的训练，分别从香气、色泽、滋味和组织状态4个方面进行综合打分。感官评价标准见表2，评价结果取平均值。
1.3.4 数据处理
每组试验平行测定3次，采用SPSS 25.0和Design-Expert V8.0.6进行数据处理，采用Origin 2021进行绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 白砂糖添加量的确定
由图1可知，随着白砂糖添加量的增加，感官评分和活菌数均呈现先升高后降低的趋势，当白砂糖添加量为4%时，感官评分最高，为（84±0.8）分，活菌数达到最大值，为（2.35±0.06）×108 CFU/mL，原因可能是糖源含量增加，能源物质增多，更利于乳酸菌生长，但当糖源物质过多时，基质碳氮比失衡、渗透压过高，抑制菌种生长和早衰[19-20]。白砂糖添加量过低或过高都会影响口感，过低时菌体不能良好生长，发酵风味不明显，反之甜度过腻而掩盖发酵饮料的清爽感[21]。因此，确定白砂糖添加量为4%。
2.1.2 菌种类型的确定
由图2可知，当植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌接种菌液体积比为1∶2时，感官评分最高，为（84.5±0.7）分，活菌数达到最大值，为（2.4±0.04）×108 CFU/mL，高于单菌株发酵组和其余比例接种发酵组，原因可能是嗜酸乳杆菌（LA）和植物乳杆菌（LP）均为乳杆菌属，发酵方式为同型乳酸发酵，当达到最佳配比时，两者对发酵具有协同作用，提高了发酵底物能源物质的转化率，活菌数上升[22]。此外，由于嗜酸乳杆菌（LA）和植物乳杆菌（LP）间的互利共生关系，使代谢产物增加，产生独特的风味[23]，感官评分升高。综合考虑，确定最佳菌种类型为植物乳酸菌和嗜酸乳杆菌接种菌液体积比1∶2。
2.1.3 菌种接种量的确定
由图3可知，感官评分在菌种接种量为1.5%～2.5%之间逐渐升高，随后逐渐降低，当菌种接种量为2.5%时，感官评分达到最大值，为（84±0.75）分。随着菌种接种量的增加，活菌数呈先上升后下降的趋势，当菌种接种量为3%时，饮料中活菌数最高，为（2.38±0.03）×108 CFU/mL，原因可能是随着菌种接种量的不断增加，发酵液中有限的营养物质不能满足其生长需求，导致菌种生长受到限制，影响饮料中活菌数，且菌种接种量过多时，产生较多的酸类化合物，感官评分降低；而菌种接种量较少时，发酵进程缓慢，影响生产效率且易被杂菌污染，产生不愉快的风味[24-25]。总之，菌种接种量过多或过少都会对发酵饮料造成不良影响。综合考虑，选择最佳菌种接种量为2.5%。
2.1.4 发酵时间的确定
由图4可知，发酵时间12 h是感官评分和活菌数变化趋势的分界点，随着发酵时间的延长，两者均呈先逐渐升高后降低的趋势，当发酵时间为12 h时，感官评分为（83±0.8）分，活菌数达到（2.4±0.03）×108 CFU/mL，两者均出现最大值；发酵时间低于12 h时，乳酸菌发酵不充分，代谢产物较少，活菌数和感官评分较低；发酵时间超过12 h时，产生的酸类化合物过多，使部分耐酸性差的菌种失活，活菌数含量减小，口感变差[26]。综合考虑，选择最佳发酵时间为12 h。
2.2 发酵条件优化响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面试验设计方案与结果
在单因素试验结果的基础上，采用Design-Expert V8.0.6中的Box-Behnken设计三因素三水平优化试验，以感官评分（Y）为响应值，以白砂糖添加量（A）、菌种接种量（B）和发酵时间（C）为影响因素，响应面试验设计及结果见表3。
2.2.2 回归模型建立和方差分析
对表3中的试验数据进行二次多项式回归分析，以感官评分（Y）为响应值，所得方程为Y=84.80+0.50A+2.25B－2.50C－1.75AB－0.75AC+3.25BC－5.78A2－4.78B2－2.77C2。进一步进行方差分析，结果见表4。
由表4可知，模型的P＜0.000 1，说明该模型极显著，失拟项的P值为0.358 6（＞0.05），说明失拟项不显著，模型的决定系数R2=0.987 2，调整决定系数RAdj2=0.970 7，说明该模型的拟合程度好。响应值Y的变异系数C.V.=1.16%（＜5%），说明试验的重复性、精确度和可信度均较高。由F值可知，试验因素对感官评分的影响大小为发酵时间（C）＞菌种接种量（B）＞白砂糖添加量（A）。
2.2.3 响应面因素交互分析
各因素之间交互作用对德昂酸茶乳酸菌发酵饮料感官评分影响的响应面图和等高线图见图5～图7。
响应面越陡峭、等高线越扁，表明两因素间交互作用对响应值的影响越显著[27]。由图5～图7可知，响应面的陡峭程度为BC＞AB＞AC，即菌种接种量与发酵时间的交互作用响应面最陡峭，对德昂酸茶乳酸菌发酵饮料感官评分的影响最大，该结果与表4中方差分析结果一致。
2.2.4 模型验证试验
采用Design-Expert V8.0.6软件对回归模型进行分析，得到德昂酸茶乳酸菌发酵饮料的最佳发酵工艺条件为白砂糖添加量4.03%、菌种接种量2.54%、发酵时间11.19 h，在此条件下，感官评分预测值为85分。考虑到现实操作问题，将上述发酵工艺条件调整为白砂糖添加量4%、菌种接种量2.5%、发酵时间12 h，并进行3次重复性验证试验，感官评分实际值为84.85分，说明该发酵工艺参数准确可靠，具有应用价值。
2.3 德昂酸茶乳酸菌发酵饮料品质指标检测
2.3.1 理化指标
以优化配方条件下制得的德昂酸茶乳酸菌发酵饮料为研究对象，测定样品的pH值、总酸含量、可溶性固形物含量、总糖含量、茶多酚含量、游离氨基酸含量，见表5。
2.3.2 微生物指标
由表6可知，经检测，德昂酸茶乳酸菌发酵饮料产品中乳酸菌为（2.3±0.03）×108 CFU/mL，大肠菌群、致病菌和霉菌均未检出，符合国家标准要求[28]。
3 结论
在单因素试验结果的基础上，进一步进行响应面优化试验，所得德昂酸茶乳酸菌发酵饮料的最佳发酵工艺条件为白砂糖添加量4%、植物乳酸菌和嗜酸乳杆菌接种菌液体积比1∶2、菌种接种量2.5%、37℃发酵12 h，生产的德昂酸茶乳酸菌发酵饮料营养物质丰富，酸茶的清香和乳酸菌的发酵香充分融合，风味独特，感官评分为84.85分，pH值为4.01±0.01，总酸含量为（0.34±0.02）g/L，可溶性固形物含量为（4.00±0.01）%，总糖含量为（2.24±0.1）g/100 mL，茶多酚含量为（13.73±0.29）g/L，游离氨基酸含量为（36.30±0.13）mg/100 mL，微生物指标均符合国家标准，该研究有利于德昂酸茶深加工产品的开发及全产业链的发展。
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