纯植物基核桃发酵乳菌种筛选及发酵工艺优化研究
2025-01-26郑靖川杨瑞娟林星弥沈钊宇田洋
摘要：发酵菌种是发酵乳发酵过程中的关键因素，该研究以核桃原浆为发酵底物，筛选出合适的发酵菌种来制备纯植物基核桃发酵乳，以解决其酸度不足、持水性差、风味不佳等问题，进一步提高该发酵乳的质构和稳定性。以持水性和感官评分为指标，采用单因素试验、响应面法优化纯植物基核桃发酵乳的发酵工艺。结果表明，筛选的最佳复配菌种为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌，以1∶1∶1的复配比发酵后的发酵乳的质构特性和感官评分达到最优；最优发酵工艺为料液比1∶5、蔗糖添加量7%、发酵温度36℃、发酵时间12 h、菌种接种量4.5%。在此条件下发酵的纯植物基核桃发酵乳质地细腻黏稠、香气适宜、口味独特，感官评分达到89.4分，相关理化指标和微生物指标均符合标准要求。此产品的开发为核桃资源的开发和利用提供了参考，为提高纯植物基核桃发酵乳的品质提供了筛菌和工艺优化的新思路。
关键词：核桃；纯植物基发酵乳；菌种筛选；发酵工艺；响应面优化
中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2025）01-0001-09
Study on Screening of Strains of Pure Plant-Based Walnut Fermented Milk and Optimization of Fermentation Process
ZHENG Jing-chuan1，2，3， YANG Rui-juan1，2，3， LIN Xing-mi1， SHEN Zhao-yu1， TIAN Yang1，2，3，4*
（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2.Engineering Research Center for the Development and Utilization of Food and Medicine Homologous Resources， Ministry of Education， Kunming 650201， China; 3.Yunnan Key Laboratory of Precision Nutrition and Personalized Food Manufacturing， Kunming 650201， China; 4.Pu'er University， Pu'er 665000， China）
Abstract： Fermentation strains are the key factor in the fermentation process of fermented milk， in this study， with walnut raw pulp as the fermentation substrate， suitable fermentation strains are selected to prepare pure plant-based walnut fermented milk， so as to solve the problems of insufficient acidity， poor water holding capacity and poor flavor， and further improve the texture and stability of the fermented milk. With water holding capacity and sensory score as the indexes， the fermentation process of pure plant-based walnut fermented milk is optimized by using single factor test and response surface method. The results show that the optimal screened compound strains are Lactobacillus bulgaricus， Streptococcus thermophilus and Lactobacillus plantarum.The texture characteristics and sensory score of fermented milk are the best by compounding at the ratio of 1∶1∶1. The optimal fermentation process is solid-liquid ratio of 1∶5， sucrose addition amount of 7%， fermentation temperature of 36℃， fermentation time of 12 h and strain inoculation amount of 4.5%. Under these conditions， the pure plant-based walnut fermented milk is fine and sticky in texture， with suitable aroma and unique taste. The sensory score reaches 89.4 points， and the relevant physicochemical indexes and microbiological indexes all meet the standard requirements. The development of this product has provided references for the development and utilization of walnut resources， and provided new ideas of strain screening and process optimization for improving the quality of pure plant-based walnut fermented milk.
Key words： walnut; pure plant-based fermented milk; strain screening; fermentation process; response surface optimization
胡桃（Juglans regia），胡桃科胡桃属植物，是我国分布最广的经济树种之一，产量位居世界首位[1]。研究表明，核桃仁中因含有丰富的不饱和脂肪酸、蛋白质、膳食纤维、维生素和矿物质等[2-3]，具有降血脂[4]、抗炎[5]、抗疲劳[6]等多种功效，是人们日常生活中优质蛋白质和脂质的摄入来源。作为世界四大坚果之一的核桃具有广阔的发展前景[7]。
与传统乳基发酵乳（酸奶）不同，纯植物基发酵乳是以植物基为原料，添加菌种，并采用生物发酵工艺制成的发酵乳[8]。因其用“植物原料”替换“动物原料”，具备植物原料不含胆固醇、低脂肪、低热量、易消化等特点[9-10]，具有适合乳糖不耐症患者和素食主义者食用[11]及减少动物饲养成本和环境污染[12-13]等优点，利用植物蛋白为发酵底物替代动物蛋白开发纯植物基发酵乳饮品已成为研究热点。
但植物发酵乳的植物蛋白种类、分子量、空间结构和动物蛋白不同，导致发酵后易出现质构不良、风味不佳、口感欠缺等诸多问题，传统解决方法大多局限于改良产品配方[14]和优化加工工艺[15]，而筛选合适的发酵菌种研究较欠缺。目前植物基发酵乳的发酵菌种主要为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这些动物发酵乳常用菌，二者互惠共生，嗜热链球菌所产甲酸、丙酮酸、叶酸等可为保加利亚乳杆菌所利用，同时保加利亚乳杆菌在发酵过程中产生的游离氨基酸和肽可为嗜热链球菌所利用[16]。有研究表明，现有益生菌核桃发酵乳的研究中，主要以传统发酵菌种混合发酵为主，现今被作为益生菌的乳杆菌有嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌等[17]。
目前，以核桃作为植物基原料完全替代乳基原料制备植物基发酵乳的相关研究较少，纯植物基核桃发酵乳的研制还处于实验室研究的初步阶段，并且我国核桃产品精深加工不足、综合利用率偏低，因此开发纯植物基核桃发酵乳具有较大的市场潜力。本研究旨在以核桃原浆作为发酵底物，通过筛选适合发酵的乳酸菌菌种，并确定最佳的配方配比和加工工艺，研制出一款风味独特、质地良好、健康营养的纯植物基发酵乳饮品，为国内特色风味纯植物基发酵乳饮料的开发提供了一定的理论支撑，同时也为开发优良的植物基发酵菌种奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
核桃：大理漾濞核桃有限责任公司；发酵菌种：实验室冷冻保存；MRS培养基：北京索莱宝科技有限公司；蔗糖：市售。
1.2 仪器与设备
JMS胶体磨 廊坊市正瑞机械有限公司；打浆机 邢台有间优宿科技有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州聚辉仪器制造有限公司；Eppendorf台式冷冻离心机 郑州今时迈科技有限公司；SRH高压均质机 上海申鹿均质机有限公司；SKD-800凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司；QSY-8数控消化炉 杭州菲跃仪器有限公司；LRH-250生化培养箱 浙江谱析仪器有限公司；YXQ-100G立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 纯植物基核桃发酵乳制作工艺流程和操作要点
1.3.1.1 工艺流程
1.3.1.2 操作要点
热泡脱皮：选择外形饱满、无霉变、无虫蛀的干核桃，去除外壳得核桃仁。使用沸水浸泡核桃仁10 min，除去种皮。
加水磨浆：在打浆机中放入核桃仁，并按照1∶5的料液比加入纯水，磨浆处理3次。
过滤：使用100目过滤网进行过滤，去除核桃浆中的不溶性固体组分。
加料：蔗糖添加量为4%，将混合核桃浆加热至45℃，并搅拌10 min。
均质：在25 MPa条件下均质3 min，循环3次，以保证原浆中各物料稳定结合。
杀菌：原浆采用85℃杀菌20 min，在不破坏原料营养和色泽的基础上，保证充分杀菌。
接种：杀菌后的原浆冷却至35～40℃，将混合菌种接种到原浆中，搅拌均匀。
发酵：接种后在36℃下恒温发酵12 h。
冷藏后熟：冷却至4℃并在4～8℃下低温储藏24 h，进一步发酵后熟产酸。
1.3.2 发酵单菌种的筛选
1.3.2.1 发酵菌种的活化
将实验室-80℃保藏的菌种恢复至室温，分别取1 mL接种到提前灭菌并冷却至室温的9 mL液体MRS培养基中，37℃恒温培养24 h。重复传代3次，活菌数达到109 CFU/mL以上，备用。
1.3.2.2 发酵指标的测定
持水性：取10～15 mL发酵完成的核桃发酵乳样品，称取样品的最初质量，以10 000 r/min离心15 min，静置10 min后，倒去上层清液，称取剩余沉淀质量，按照下式计算发酵乳的持水性。
发酵乳持水性（%）=沉淀质量（g）/样品质量（g）×100%。
黏度：将核桃发酵乳发酵至pH值为4.5，破乳恢复至室温，采用Brookfield DV3T黏度计3号转子，转速为60 r/min，测定30 s时样品的黏度。
凝乳时间：将活化好的菌种按照1.3.1的操作发酵至凝乳，记录凝乳时间。
发酵终点时间：以发酵乳的pH值达到4.5为发酵终点，记录发酵终点时间。
发酵终点酸度：发酵乳酸度的测定按照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》中的酚酞指示剂法[18]，记录发酵终点酸度。
1.3.2.3 菌种产酸能力的测定
将11种待测菌种活化后，按照1.3.1的发酵工艺进行接种发酵，每隔2 h分别取样测定其酸度，酸度按照1.3.2.2中的酸度测定法测定，并绘制产酸曲线。
1.3.3 优势菌种组合发酵筛选试验
根据1.3.2选取具有良好发酵核桃原浆性能的乳酸菌进行菌种组合筛选，并按照菌种浓度1∶1∶1的比例，以4.5%的接种量接种到灭菌的核桃原浆中，36℃恒温发酵12 h，发酵完成后放入4℃冰箱中冷藏后熟24 h后进行质构检测和感官评价，选出质构良好且感官评价最优的最佳菌种组合。
1.3.3.1 质构的测定
发酵乳全质构测定：质构仪测试模式选择全质构测试，探头型号为TA/36R，测前、测中、测后速度均为1 mm/s，触发力为4 g。
1.3.3.2 感官评价
纯植物基核桃发酵乳的感官评价参考国标GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》的规定进行。由10名经过专业品鉴培训的人员组成感官评判小组，分别从视觉层面——色泽（20分）、味觉层面——滋味（20分）、嗅觉层面——气味（30分）、触觉层面——组织状态（30分）4项指标对发酵乳打分，总分100分，具体感官评价标准见表1。
1.3.4 发酵工艺优化
1.3.4.1 单因素试验
以持水性和感官评分为评价指标，将料液比、蔗糖添加量、发酵温度、发酵时间、菌种接种量设为单因素，每个单因素设置5个试验水平，依次考察料液比（1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9）、蔗糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、发酵温度（32，34，36，38，40℃）、发酵时间（8，10，12，14，16 h）、菌种接种量（1.5%、3%、4.5%、6%、7.5%）对纯植物基核桃发酵乳品质的影响。
1.3.4.2 响应面优化试验
在单因素试验结果的基础上，以纯植物基核桃发酵乳的发酵温度、发酵时间、菌种接种量为自变量，利用Design-Expert软件中Box-Behnken程序在三因素三水平的条件下进行响应面分析，对纯植物基核桃发酵乳的最佳发酵工艺配方进行可行性优化。Box-Behnken试验因素与水平见表2。
1.3.5 纯植物基核桃发酵乳理化指标和微生物指标的测定
发酵乳的pH值使用pH计测定；蛋白质含量按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定[19]；乳酸菌活菌数按照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定[20]；大肠杆菌按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》测定[21]；致病菌按照GB 29921—2021《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》测定[22]。
1.4 数据处理
采用软件GraphPad Prism 8.0.2和IBM SPSS Statistics 26对试验数据进行处理和统计分析，利用Design-Expert 8.0.6进行响应面分析，每项试验至少平行3次。
2 结果与分析
2.1 发酵单菌种筛选结果
2.1.1 不同菌种发酵指标测定结果与分析
一般发酵乳饮品的菌种筛选主要以凝乳时间、发酵终点时间和酸度作为衡量指标，凝乳时间和发酵终点时间短且产酸能力强的菌种一般可视为发酵活力强，可缩短发酵时间，广泛应用于发酵工业。由表3可知，罗伊氏乳杆菌、约氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌的凝乳时间和发酵终点时间较长，分别在15～18 h和18～21 h之间，发酵终点酸度偏低，在30～40°T之间，根据《植物蛋白饮料 植物酸奶》中规定植物基发酵乳的酸度应该大于30°T，综合可知，其对核桃原浆的发酵能力较差。而保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌表现出较强的发酵产酸能力，发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌也表现出不错的发酵产酸能力，虽然不如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，但一般发酵乳多采用多菌种复配，将其与发酵能力强的菌种复配，可对发酵乳的质构、风味等产生积极影响。
与乳基发酵乳不同，纯植物基发酵乳由于植物蛋白种类、分子量、空间结构和动物蛋白不同[23]，并且缺乏乳清和酪蛋白，不能很好地建立三维立体结构来锁住游离水分，极易出现水相分离的问题，进而影响产品品质，因此将发酵乳的持水性和黏度作为筛菌指标。由表3可知，发酵能力强的菌种的持水性和黏度都较高，嗜热链球菌因具有以产黏为主的作用，持水性和黏度最高，分别达到48.6%和448.3 mPa·s。
2.1.2 不同菌种产酸能力结果与分析
通常产酸能力强的菌种被广泛选为发酵菌种，菌种发酵过程中产酸速度也决定了发酵乳的发酵周期，对产品的口感、风味和卫生安全有着重要影响。由图1可知，除了保加利亚乳杆菌在第6 h酸度开始迅速增长外，其他菌种在8～14 h快速增长，14 h后酸度增长基本趋于稳定。由发酵开始到发酵结束，保加利亚乳杆菌的酸度由12.7°T上升到74.6°T，酸度增加了61.9°T，产酸能力最强。植物乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的酸度分别增加了61.8，57.6，55.9，51.7，44.3，43.7°T。相比之下，约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的酸度增长较小，分别为36.9，31.5，30.6，28.1°T，由于产酸过慢且产酸较少，在发酵过程中周期较长，容易造成品质不佳和产品污染，因此不适合作为发酵菌种。
根据表3和图1的结果，最终将产酸能力最强的保加利亚乳杆菌和产黏能力最强的嗜热链球菌作为基础发酵菌种，而发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌和嗜酸乳杆菌作为待定搭配菌种，以此进一步进行最佳菌种组合发酵试验。
2.2 菌种组合筛选结果
2.2.1 不同菌种组合对纯植物基核桃发酵乳质构的影响
由表4可知，菌种组合L1+L2+L5发酵的发酵乳的各项质构参数在所有组合中最佳，发酵乳的硬度和胶黏性参数受不同发酵菌种组合的影响较大。发酵乳的硬度是其凝胶结构体系的特征，较好的硬度有利于发酵乳的运输和储存，菌种组合L1+L2+L5和L1+L2+L7的发酵乳在硬度方面比较出色。菌种组合L1+L2+L5的发酵乳在胶黏性方面表现出色，发酵乳的胶黏性是发酵乳可被其他物体黏附的能力，较高的胶黏性使发酵乳具有较好的黏性，进而表明发酵乳具有较好的流变特性[24]，对发酵乳的口感具有显著影响，并且发酵乳的胶黏性高可降低乳饮料的离心沉淀率[25]，适合生产乳酸菌饮料。综合比较可得，菌种组合L1+L2+L5在纯植物基核桃发酵乳的质构方面表现最优。
2.2.2 不同菌种组合对纯植物基核桃发酵乳感官评分的影响
由表5可知，不同菌种组合对发酵乳色泽和气味的影响较小，但对发酵乳的滋味、组织状态有显著影响。滋味不良主要表现在由酸度不足导致发酵乳的风味不佳，缺乏发酵乳特有的酸甜口味，主要原因是菌种发酵过程中产酸不足和产酸速度过慢，无法在指定时间内达到特定酸度要求。组织状态不佳表现在发酵乳质构不佳，体系结构呈块状，黏稠度低，并且水相分离严重，主要原因可能是菌种发酵过程中所产胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）量不同导致黏性不同，乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在发酵过程中产生的黏性物质[26]，发酵乳的黏稠性与胞外多糖的量有着直接关系。菌种组合L1+L2+L5在发酵乳的滋味和组织状态方面表现都非常出色。
综合表4和表5中结果，最终将最优发酵菌种组合确定为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌。
2.3 单因素试验结果
2.3.1 料液比对纯植物基核桃发酵乳品质的影响
核桃原浆的不同料液比对纯植物基核桃发酵乳品质的影响见图2。
由图2可知，当料液比为1∶1～1∶5时，发酵乳的感官评分持续快速增加，发酵乳的持水性呈现缓慢增加的趋势；当料液比为1∶5时，感官评分达到最大值85.6分，此时持水性为59.4%；当料液比为1∶5～1∶9时，感官评分和持水性均逐渐下降，这是由于料液比过大时，核桃中以酮类为主要呈香物质，因过度稀释导致香味不突出，口味偏淡，并且与传统乳基发酵乳不同，纯植物基发酵乳因植物蛋白种类、分子量、空间结构与动物蛋白不同，较高的料液比使其网状结构体系很不稳定，导致发酵乳体系水相分离严重，影响发酵乳的整体品质；当料液比过大时，核桃原浆浓度过大，气味浓郁而无法体现核桃的清香，过于浓稠的发酵底物也使发酵过程中乳酸菌不能均匀发酵核桃原浆，进而导致产酸不足，影响核桃发酵乳的口感。因此，最适料液比为1∶5。
2.3.2 蔗糖添加量对纯植物基核桃发酵乳品质的影响
不同蔗糖添加量对发酵乳产品持水性和感官评分的影响见图3。
由图3可知，当蔗糖添加量为1%～7%时，发酵乳的持水性和感官评分均呈升高趋势；当蔗糖添加量为7%时，感官评分达到最高，为86.4分，此时持水性为56%；当蔗糖添加量大于7%后，感官评分下降，但是持水性缓慢上升。在传统发酵生产工艺中添加蔗糖的主要原因：添加适量蔗糖可以调节发酵乳的糖酸比例进而增加发酵产品的味感，并增加产品的渗透压，减少杂菌污染来保证产品的质量安全和延长产品的货架期，同时蔗糖的添加可为乳酸菌提供生长繁殖所需的能量。因此通过试验证实，当蔗糖添加量过少时，乳酸菌生长繁殖缓慢，活力较低，导致核桃原浆所需发酵时间较长，极易引起体系水相分离和味道过酸，体系水相分离严重会进一步导致发酵乳的持水性下降，从而影响发酵乳的品质。蔗糖添加量过多时，会导致发酵乳产品过甜，遮盖了产品原有核桃醇厚的风味，口味变差。因此，核桃发酵乳最适的蔗糖添加量为7%。
2.3.3 发酵温度对纯植物基核桃发酵乳品质的影响
不同发酵温度对发酵乳产品持水性和感官评分的影响见图4。
由图4可知，当发酵温度为32～36℃时，发酵乳的持水性和感官评分均升高；当发酵温度为36℃时，感官评分和持水性均达到最高，分别为85.4分和60%；当发酵温度大于36℃后，发酵乳的感官评分大幅度下降，其持水性也呈逐渐下降的趋势。当发酵温度过低时，乳酸菌种活性偏低，其产酸能力较弱，导致发酵乳中因风味物质发酵不充分而风味较差，并且因乳酸菌活性不高导致的发酵不充分也使发酵乳结构体系不稳定，进而表现出较低的持水性；当发酵温度过高时，发酵乳体系酸化程度较大，以植物蛋白为发酵底物的植物基发酵乳极易形成不良的酸馊味，并且较高的发酵温度使核桃中的挥发性醛类物质大量挥发，产生过多的不良“草味”，还会导致产品体系水相分离严重。综上，相对于低温发酵，较高的发酵温度更易影响发酵乳的口感、风味和外观品质。在适宜的发酵温度下，纯植物基核桃发酵乳能够获得纯净的香气、细腻的口感和稳定的结构体系。因此，最适发酵温度为36℃。
2.3.4 发酵时间对纯植物基核桃发酵乳品质的影响
不同发酵时间对发酵乳产品持水性和感官评分的影响见图5。
由图5可知，当核桃原浆的发酵时间为8～12 h时，发酵乳的感官评分和持水性均呈现升高趋势；当发酵时间为12 h时，产品的感官评分和持水性均达到最高，分别为84.4分和59.6%；当发酵时间大于12 h后，因发酵过度导致发酵乳体系酸度持续上升，酸味过重使感官评分持续下降。因为核桃中的核桃油含有丰富的不饱和脂肪酸甘油酯，容易氧化、酸败和变质，因此发酵时间过长会导致核桃原浆在发酵过程中氧化严重，使发酵乳表面容易产生紫色色变，严重影响产品的色泽和风味；发酵时间过短会导致其发酵不完全，使发酵乳的呈味物质未完全体现，从而导致香气不足，并且因为发酵不完全导致乳酸菌所产的胞外多糖不足，乳酸菌分泌的胞外多糖作为一种天然的增稠剂和稳定剂被广泛应用于发酵乳结构质地的改善，因此缺乏胞外多糖使发酵乳体系缺少黏性，导致发酵乳体系水分析出过多，水相分离严重，影响体系的稳定性，进而使口感不佳。因此，纯植物基核桃发酵乳的最适发酵时间为12 h。
2.3.5 菌种接种量对纯植物基核桃发酵乳品质的影响
不同菌种添加量对发酵乳产品持水性和感官评分的影响见图6。
由图6可知，在制作纯植物基核桃发酵乳时接种1.5%～4.5%的菌种，发酵乳的感官评分和持水性随之增加；当接种4.5%的菌种时，感官评分和持水性均达到最高值，分别为86分和58.6%；当菌种接种量超过4.5%后，感官评分下降，持水性也缓慢下降。因为保加利亚乳杆菌具有较强的产酸能力，嗜热链球菌有较强的产黏能力，当菌种接种量过少时，发酵不充分，发酵乳的酸度和体系黏度不足，导致风味和口感不佳；菌种接种量过大时，产酸过多，导致发酵乳的酸味过重，发酵乳体系酸度过高使水分析出严重，导致发酵乳呈豆腐渣状和团块状，对发酵乳的呈香呈味产生负面影响。因此，最适菌种接种量为4.5%。
2.4 响应面优化试验设计和结果分析
2.4.1 建立回归模型和方差分析
在单因素试验结果的基础上，选取发酵温度（X1）、发酵时间（X2）、菌种接种量（X3）3个因素，以感官评分（Y）为响应值，采用响应面试验对核桃发酵乳加工工艺进行优化，试验设计和结果见表6，方差分析结果见表7。
使用Design-Expert 8.0.6软件对表6中数据进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程：Y=89.28+1.42X1+0.36X2+2.71X3-0.67X1X2+1.33X1X3-0.10X2X3-5.11X12-5.19X22-7.34X32。
由表7可知，该试验感官评分二次多元回归模型的P值＜0.000 1，说明该回归模型极显著（P＜0.01）。此外，回归模型失拟项的P值为0.252 9（Pgt;0.05），表明该回归模型的失拟结果不显著，综上可得，该回归模型方差分析结果与实际结果非常接近，因此，此二次多元回归模型适用于拟合试验。通过进一步分析该回归模型可得，模型的决定系数R2=0.993 1，说明该模型能够解释99.31%的响应值变化，存在0.69%的总变异，表明该模型的拟合度好、可信度高，试验的误差较小，因此可应用于纯植物基核桃发酵乳的感官评价。模型响应值Y的变异系数（coefficient of variation，C.V.）是标准值与平均值的比值，C.V.可以直接反映出试验的精准度，且与试验的精准度和重复性成反比，其值越大代表可靠性越差，本试验感官评分拟合中的C.V.=0.94%＜5%，表明试验的精准度和重复性都较高，且可信度较高。
由P值可知，一次项X1、X3，二次项X12、X22和X32之间的交互作用均极显著（P＜0.01），对纯植物基核桃发酵乳感官评分的影响较大；交互项X1X3对结果的影响显著（P＜0.05）；交互项X1X2和X2X3对结果的影响不显著（P＞0.05），对纯植物基核桃发酵乳感官评分的影响较小。3个因素对纯植物基核桃发酵乳感官评分的影响程度为菌种接种量（X3）＞发酵温度（X1）＞发酵时间（X2）。
2.4.2 各因素间交互作用的影响
响应面陡峭越明显、等高线越密集且呈椭圆形，表明两因素的交互作用对试验结果的影响越显著。因此，两因素具有非常明显的交互作用时，等高线的形状为椭圆形或马鞍形，没有显著的交互作用时，等高线的形状为圆形。通过Design-Expert软件中的响应面优化分析方法得出纯植物基核桃发酵乳的发酵温度、发酵时间、菌种接种量各因素交互作用对感官评分影响的响应面图和等高线图，见图7～图9。交互项X1X3的曲面倾斜度较大、坡度较陡，且等高线呈椭圆形、较密集，说明其交互作用显著，与方差分析结果一致。
2.4.3 最佳发酵条件的确定和验证试验
通过Design-Expert软件分析得到最佳工艺条件为发酵时间12.05 h、发酵温度36.33℃、菌种接种量4.8%，在此优化条件下，感官评分理论值达到89.7分。为了验证模型的精准性，考虑到现有设备的参数和发酵乳产品制作的实际操作，根据可行性最终将发酵工艺条件参数调整为发酵时间12 h、发酵温度36℃、菌种接种量4.5%，采用此工艺条件进行3次平行验证试验，此时感官评分达到89.4分，与预测值相近，说明该模型适用于纯植物基核桃发酵乳发酵工艺的优化，具有良好的应用价值。
2.5 纯植物基核桃发酵乳理化指标和微生物指标分析
由表8可知，酸度为（76.4±2.2）°T，蛋白质含量为（4.16±0.15） g/100 g，乳酸菌含量为1.68×109 CFU/g，大肠杆菌和致病菌均未检出，理化指标和微生物指标均符合标准T/WSJD 12—2020《植物蛋白饮料 植物酸奶》的相关要求。该发酵乳是一款美味营养、健康安全、天然无添加的纯植物基发酵乳产品。
3 结论
本研究通过筛选合适的发酵菌种对核桃原浆进行发酵，制备纯植物基核桃发酵乳，缓解了原核桃发酵乳存在的口感粗糙、风味不佳的问题。以持水性和感官评分为指标，在单因素试验的基础上进行响应面优化试验，确定了最佳发酵工艺条件为料液比1∶5、蔗糖添加量7%、发酵温度36℃、发酵时间12 h、菌种接种量4.5%。在此条件下纯植物基核桃发酵乳口感细腻、香味浓郁、结构稳定，感官评分达到89.4分，相关理化和微生物指标均符合国家相关标准要求。该发酵乳是一款风味独特的纯植物基发酵乳新产品，对核桃资源的利用和满足消费者对纯植物基发酵乳的多元化选择具有一定促进作用，并为后续纯植物基发酵乳的发酵剂复配提供了一定的理论基础。
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