蓝莓来源的外泌体样纳米颗粒在MNNG诱导人正常胃黏膜上皮细胞恶性转化中的干预效应

［摘要］ 目的： 提取蓝莓来源的外泌体样纳米颗粒（blueberry derived exosome-like nanoparticles，BELNs）并进行鉴定，探讨BELNs在1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguallidine，MNNG）诱导人正常胃黏膜上皮细胞恶性转化中的干预效应。方法： 采用超速离心法提取BELNs，纳米颗粒跟踪分析仪和透射电镜分别从粒径、Zeta电位、形态对获取的BELNs进行鉴定；激光共聚焦显微镜观察BELNs能否被MNNG诱导的人正常胃黏膜上皮细胞，即胃黏膜上皮细胞转化细胞（transformed gastric mucosal epithelial cells，TGES-1）内吞；用200、400 μg/mL的BELNs处理TGES-1细胞72 h后，蛋白质印迹法分析干性基因、上皮细胞间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及增殖相关蛋白表达的变化。结果： 纳米颗粒跟踪分析仪和透射电镜等结果显示BELNs符合外泌体样纳米颗粒的特征，表明成功提取BELNs；激光共聚焦显微镜结果提示BELNs可被TGES-1细胞内吞；蛋白印迹结果表明，400 μg/mL的BELNs抑制TGES-1细胞中N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、同源框蛋白（Nanog） 和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表达，增强E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达。结论： BELNs在MNNG诱导人正常胃黏膜上皮细胞恶性转化中具有明显的干预效应。

［关键词］ 蓝莓来源的外泌体样纳米颗粒；1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍；胃黏膜上皮细胞；恶性转化；干预效应

［中图分类号］ R737.14" ［文献标志码］ A" ［文章编号］ 1671-7783（2025）01-0052-04

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230309

［引用格式］宋佳佳， 张轩， 高子涵， 等. 蓝莓来源的外泌体样纳米颗粒在MNNG诱导人正常胃黏膜上皮细胞恶性转化中的干预效应［J］. 江苏大学学报（医学版）， 2025， 35（1）： 52-55， 61.

［基金项目］江苏省研究生科研与实践创新计划项目（KYCX20_3089）；江苏大学“青年英才培育计划”优秀青年骨干教师培育项目；大学生创新训练项目（202310299476X）

［作者简介］宋佳佳（2000—），女，硕士研究生；梁照锋（通讯作者），副教授，硕士生导师，E-mail： liangzhaofeng@ujs.edu.cn

Intervention effect of blueberry derived exosome-like nanoparticles on MNNG-induced malignant transformation of human gastric epithelial cells

SONG Jiajia， ZHANG Xuan， GAO Zihan， XU Wenrong， QIAN Hui， LIANG Zhaofeng

（School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013， China）

［Abstract］ Objective： "Blueberry derived exosome-like nanoparticles （BELNs） were extracted and identified， and the intervention effect of BELNs on the malignant transformation of human normal gastric mucosal epithelial cells induced by （N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguallidine， MNNG） was investigated. Methods： The BELNs were extracted by ultracentrifugation， and the BELNs were identified with particle size， Zeta potential and morphology by nano-particle tracking analyzer and transmission electron microscopy. Laser confocal microscopy was used to observe whether BELNs could be endocytosed by transformed gastric mucosal epithelial cells （TGES-1）. TGES-1 cells were treated with 200 and 400 μg/mL BELNs for 72 h， then Western blotting was used to analyze the expression of stemness genes， epithelial-mesenchymal transition （EMT） and proliferation related proteins. Results： The results of nano-particle tracking analyzer and transmission electron microscopy showed that BELNs was matched with the characteristics of exosome-like nanoparticles. The results of laser confocal microscopy confirmed that BELNs could be endocytosed by TGES-1 cells. Western blotting showed that 400 μg/mL BELNs inhibited the expression of N-cadherin， E-cadherin， Vimentin， Nanog and proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and enhanced expression of E-cadherin in TGES-1 cells. Conclusion： BELNs exert a significant intervention effect on human normal gastric mucosal epithelial cells induced by MNNG.

［Key words］ blueberry derived exosome-like nanoparticles; MNNG; gastric epithelial cells; malignant transformation; intervention

胃癌是导致人类死亡的主要恶性肿瘤之一。我国胃癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤第3位，发病和死亡人数居世界之首^［1-2］ 。幽门螺杆菌感染、饮酒、吸烟、高盐摄入量以及水果和蔬菜摄入量低等都是胃癌发病的高危因素^［3］ 。

N-亚硝基化合物是一种强致癌剂，腌制食品、加工肉制品和高盐饮食等是其主要来源，N-亚硝基化合物的暴露与胃癌的发生发展密切相关。1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguallidine，MNNG）是研究N-亚硝基化合物致癌机制常用的模式化合物^［4-5］ 。

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是指从细胞膜剥离或由细胞分泌的具有膜结构的囊泡，直径范围为40～1 000 nm，在多种生理和病理进程中具有重要的调节作用^［6-7］ 。植物外泌体样纳米颗粒（plant "derived exosome-like nanoparticles，PELNs）具有与哺乳动物外泌体相似的结构和功能。与EVs相比，PELNs具有生物活性独特、来源广泛、易被吸收、成本效益高和生物安全性高的特点，适合用于临床转化和疾病干预等研究^［8］ 。

蓝莓是杜鹃花科越橘属，含有多酚、花青素和类黄酮等抗氧化成分，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性，可以中和体内自由基的氧化反应，改善代谢功能和认知能力。蓝莓中的花青素能够阻止肿瘤细胞的增殖和扩散，从而抑制癌症的发生^［9-11］ 。本研究分离提取蓝莓来源的外泌体样纳米颗粒（blueberry derived exosome-like nanoparticles，BELNs）并进行鉴定，探讨该BELNs在胃黏膜上皮细胞转化细胞（transformed gastric mucosal epithelial cells，TGES-1）恶性转化中的干预效应，为蓝莓及其外泌体样纳米颗粒在胃癌防治中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM培养基、胰酶、胎牛血清（美国Gibco公司）；PMSF+RIPA（美国Invitrogen公司），BCA试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司），PVDF膜（德国Millipore公司），PBS（大连美仑生物技术有限公司），0.22 μm无菌滤膜（德国Millipore公司）；N-钙黏蛋白（N-cadherin）、增殖细胞核抗原（proliferating "cell nuclear antigen，PCNA）、同源框蛋白（Nanog）、波形蛋白（Vimentin）一抗（美国CST公司），E-钙黏蛋白（E-cadherin）、GAPDH（美国Bioworld公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司），ImageQuant LAS4000mini化学发光成像仪、激光共聚焦显微镜（日本GE公司），倒置式生物显微镜（日本Nikon公司），Nanosight纳米颗粒分析仪（德国Particle Metrix公司），透射电子显微镜（荷 兰Philips公司），台式离心机（德国Eppendorf公司），超速离心机（美国Beckman公司）。

1.2 细胞系及细胞培养

TGES-1细胞由本实验构建，细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基中生长，并置于含5% CO2 的37 ℃细胞培养箱中培养。

1.3 BELNs的提取与纯化

取适量新鲜蓝莓，用双蒸水洗净，榨取蓝莓汁；将蓝莓汁在4 ℃下连续差速离心后取上清液；将取得的蓝莓上清液超速离心，4 ℃、150 000× g 离心90 min后 取沉淀；将沉淀重悬于冰PBS中。接着，分别配制15%、30%、45%、60%浓度的蔗糖溶液，与BELNs沉淀悬液一起依次加入离心管中，再进行超速离心，4 ℃、150 000× g 离心120 min；吸取30%～45%蔗糖溶液间的分层，重悬于大量冰PBS中；再次超速离心，4 ℃、150 000× g 离心90 min，所得沉淀重悬于冰PBS，并用0.22 μm的滤膜过滤，获得无菌的BELNs。

1.4 透射电镜检测BELNs形态

取10～20 μL BELNs悬液滴加在载样铜网上，吸附3 min后用磷钨酸（pH=6.8）在室温下负染1 min ，白炽灯下烤干，随后在透射电镜下观察并拍照。

1.5 纳米颗粒跟踪分析仪检测BELNs大小

打开Nanosight机器电源预热约30 min，开启软件，纯净水清洗仪器；纯净水稀释BELNs至合适的比例，充分混匀；使用1 mL注射器吸取稀释后的BELNs注射到进样口检测。

1.6 激光共聚焦显微镜观察细胞对BELNs内吞情况

1.6.1 铺板 超净工作台内，吸取适量DMEM培养基加入12孔板中，用镊子夹取玻片，使玻片充分黏附于孔底。将对数生长期的TGES-1细胞，按照6 000个/ 孔接种于细胞爬片上，置于含5% CO2 的37 ℃细胞培养箱中培养。

1.6.2 TGES-1细胞内吞Dil标记的BELNs 取Dil染液按1∶1 000比例与BELNs避光孵育30 min，孵育完毕后，将染色后的BELNs吸至超滤管中3 000× g 离心15 min，0.22 μm滤器过滤后，加到12孔板的贴壁细胞中，置于含5% CO2 的37 ℃细胞培养箱中培养24 h。

1.6.3 染色与显微镜观察 将培养24 h后的12孔板用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，每次5 min ；DAPI核染料覆盖爬片，室温染色20 min，弃去染液，PBS清洗3次，每次5 min ；封片、固定，置于激光共聚焦显微镜（60×）下拍照并保存图像。

1.7 CCK8筛选BELNs作用的适宜浓度

用DMEM培养基将BELNs稀释至不同蛋白浓度（0、100、200、400、600和800 μg/mL），通过CCK8检测BELNs作用TGES-1细胞后的细胞活力。具体步骤：采用预热的胰酶消化细胞2 min ，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心后收集细胞计数，按每孔1×10³ 个细胞接种于96孔板中，每个浓度梯度重复5个孔，每孔加入100 μL培养基，空白对照组采用无细胞的DMEM培养基。在外围孔添加PBS以防止培养基挥发过度。培养24 h后弃去培养基，沿孔壁重新加90 μL培养基及10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h后读取450 nm波长下光密度（ D ）值，检测过程避光，连续检测3 d。以时间为横坐标， D （450 nm）值为纵坐标绘制曲线。

1.8 蛋白质印迹检测干性基因、上皮细胞间充质转化（EMT）及增殖相关蛋白的表达

分别用200和400 μg/mL的BELNs处理TGES-1细胞72 h，按照蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，并测定蛋白浓度。12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质。将蛋白质转移到0.22 μm "PVDF膜上，在5%脱脂牛奶中封闭1～2 h，然后与GAPDH（1∶2 000）、PCNA（1∶1 000 ）、Nanog（1∶1 000 ）、Vimentin（1∶1 000 ）、N-cadherin（1∶1 000 ）、E-cadherin（1∶1 000 ）在4 ℃孵育过夜，1×TBST清洗3次，每次5 min；二抗孵育1 h，1×TBST清洗5次，每次10 min，然后通过化学发光分析仪进行检测。

1.9 统计学分析

应用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（ x±s ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用SNK- q 检验， P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BELNs的提取及鉴定

采用超速离心法从新鲜的蓝莓中提取BELNs，并通过纳米颗粒跟踪分析仪和透射电镜分别从粒径、Zeta电位、形态对获取的BELNs进行鉴定。蔗糖密度梯度离心纯化后出现3个分层（图1A）。经鉴定，BELNs的平均粒径为198.6 nm（图1B），Zeta电位约为-35.19 mV（图1C）。透射电子显微镜观察提取的BELNs呈现茶托状的膜性小囊泡结构（图1D）。

2.2 BELNs能被MNNG诱导的TGES-1细胞内吞

采用Dil荧光染料标记BELNs，DAPI标记细胞核，用标记后的BELNs处理TGES-1细胞24 h后，共聚焦显微镜观察发现，红色荧光的BELNs能够被TGES-1细胞内吞到细胞内（图2）。

2.3 BELNs抑制MNNG诱导TGES-1细胞的EMT进程、干性及增殖能力

用不同蛋白浓度的BELNs处理TGES-1细胞并通过CCK8测定其细胞活力（图3A），综合结果考虑，选择用200和400 μg/mL浓度的BELNs处理72 h。

蛋白质印迹结果显示，400 μg/mL的BELNs能抑制TGES-1细胞中N-cadherin、Vimentin、Nanog和PCNA蛋白的表达，增强E-cadherin蛋白的表达，从而抑制其EMT进程、干性及增殖能力（图3B、3C）。

3 讨论

由于胃癌早期诊断率和5年生存率仍处于较低水平^［12］ ，探寻胃癌新的早期防治策略尤为重要。研究发现，MNNG等N-亚硝基化合物长期暴露可显著增加胃癌发病风险^［13-14］ ，但MNNG诱发胃癌的干预策略尚不明确。

近年来，人们开始关注天然植物化学物的生物作用^［15］ 。闫庆韬等^［16］ 研究发现刺槐素可能通过降低血管内皮生长因子的表达进而抑制肺癌A549细胞迁移、侵袭和血管生成。尽管天然植物化学物具有抗癌、防癌作用，但有用药安全性不高、口服剂量大和生理利用率低等缺点。本研究提取了BELNs，其平均粒径约为200 nm，具有脂质双层膜结构，呈茶托状。相较于植物化学物，BELNs等食用植物来源纳米颗粒的生物相容性更好、安全性更高、更易被机体吸收利用。蓝莓具有抗癌、抗炎、抗心血管疾病以及保护视力的作用^［17］ 。姜桥等^［18］ 研究发现，蓝莓紫檀芪在控制肿瘤细胞增殖、自噬和凋亡方面有显著作用；并且参与遗传因子的调控，控制肿瘤细胞与上皮间质之间的转化。本研究用不同浓度BELNs处理TGES-1细胞，研究结果显示，400 μg/mL的BELNs能够降低MNNG诱导的TGES-1细胞N-cadherin、Vimentin、Nanog和PCNA蛋白表达水平，增加E-cadherin蛋白表达水平，抑制了TGES-1细胞的EMT进程、干性及增殖能力，在一定程度上显示出抗肿瘤效应。

综上所述，本研究结果初步显示了BELNs对TGES-1细胞的干预效应，发现BELNs能够抑制TGES-1细胞的EMT进程、干性及增殖能力。BELNs作为一种从食用植物中提取的外泌体，不仅具有天然的生物活性，来源广泛，生物相容性高，且在MNNG诱导人正常胃黏膜上皮细胞发生恶性转化的过程中具有显著的干预效应，有望成为胃癌早期干预的新兴手段。后续研究中将进一步探讨干预效应的分子机制，提升BELNs在胃癌防治中的临床应用价值。

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［收稿日期］ 2023-12-22" ［编辑］ 郭 欣