阳和贴治疗阳虚体质糖耐量减低的代谢组学研究

[摘要]"目的"探讨阳和贴穴位贴敷治疗阳虚体质糖耐量减低（impaired"glucose"tolerance，IGT）患者的效果及其对血清代谢物的影响。方法"选取2022年10月至2024年1月于浙江中医药大学附属宁波市中医院就诊的63例IGT患者，以分层随机化法分为对照组（32例）和治疗组（31例），比较两组患者治疗前后的血糖、血脂、肿瘤坏死因子α（tumor"necrosis"factor-α，TNF-α）、阳虚体质评分与红外线热成像温度。另选取同期29名健康体检者作为健康组，采用液相色谱-质谱（liquid"chromatograph-mass"spectrometer，LC-MS）技术对三组纳入者的血清代谢产物进行分析，结合主成分分析、潜在结构判别分析等方法分析特征性差异代谢物，运用MetaboAnalyst软件进行网络分析以筛选关键代谢通路。结果"阳和贴干预后治疗组患者的空腹血糖、糖化血红蛋白、三酰甘油、低密度脂蛋白、TNF-α水平均下降（Plt;0.05）；治疗组患者的阳虚体质评分下降（Plt;0.05），任脉、督脉、中焦、下焦温度均升高（Plt;0.05），上焦温度下降（Plt;0.05）。代谢组学分析发现阳虚体质IGT患者血清中的差异表达代谢物主要为4-乙酰氨基丁酸、3-脱氢胆酸、柠檬酸、胱氨酸等16个，治疗组出现差异表达的代谢物包括二氨基庚二酸、乙酰左旋肉碱、单丁酯等16个。经MetaboAnalyst分析，发现IGT阳虚体质的形成与三羧酸循环、氨基酰生物合成代谢通路、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸（glycine，serine"and"threonine，Gly-Ser-Thr）代谢轴有关，且阳和贴的针对性治疗与Gly-Ser-Thr代谢轴、鞘脂类代谢相关通路相关。结论"阳和贴穴位贴敷可缓解阳虚体质IGT人群的血清慢性炎症、改善阳虚症状，代谢组学分析发现多种差异性代谢物与其作用机制有关，其中Gly-Ser-Thr代谢轴相关代谢通路是调护IGT阳虚体质的关键通路。

[关键词]"糖耐量减低；中医体质学；穴位贴敷；代谢组学；阳和贴；阳虚体质

[中图分类号]"R259""""""[文献标识码]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.33.002

Study"on"plasma"metabolomics"analysis"of"Yanghe-patch"in"the"treatment"of"impaired"glucose"tolerance"with"Yang-deficiency"constitution

LU"Xueke1，2，"WENG"Siying1，"ZHOU"Jianyang1

1.Department"of"Endocrinology，"Ningbo"Municipal"Hospital"of"TCM"Affliated"to"Zhejiang"Chinese"Medicalnbsp;University，"Ningbo"315010，"Zhejiang，"China;"2.The"Third"Clinical"Medical"College，"Zhejiang"Chinese"Medical"University，"Hangzhou"310053，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"impact"of"Yanghe-patch"acupoint"in"the"treatment"of"impaired"glucose"tolerance"（IGT）"with"Yang-deficiency"constitution"and"its"influence"on"serum"metabolites."Methods"The"study"enrolled"a"total"of"63"patients"with"IGT"were"randomly"selected"and"stratified"into"two"groups："The"control"group"（32"cases）"and"the"treatment"group"（31"cases）"at"Ningbo"Municipal"Hospital"of"TCM"Affliated"to"Zhejiang"Chinese"Medical"University"from"October"2022"to"January"2024，"blood"glucose，"blood"lipids，"tumor"necrosis"factor-α"（TNF-α），"Yang-deficiency"body"mass"score，"and"infrared"thermal"imaging"temperature"before"and"after"treatment"were"compared"between"two"groups."Furthermore，"29"healthy"individuals"were"selected"as"healthy"negative"controls，"and"their"serum"metabolites"were"analyzed"by"using"liquid"chromatograph-mass"spectrometer"（LC-MS）"among"three"groups."Principal"component"analysis"and"orthogonal"projections"to"latent"structures-discriminate"analysis"were"employed"to"identify"characteristic"differential"metabolites."Additionally，"key"metabolic"pathways"were"screened"through"network"analysis"by"using"MetaboAnalyst"software."Results"The"treatment"group"after"Yanghe-patch"showed"significant"reductions"in"fasting"blood"glucose，"glycosylated"hemoglobin，"triglycerides，"low-density"lipopro-"tein"and"TNF-α"levels"（Plt;0.05）."Additionally，"Yang-deficiency"constitution"conversion"points"significantly"decreased"within"the"treatment"group"（Plt;0.05），"while"there"were"significant"increases"in"the"temperatures"of"Ren"channel，"Du"channel，"middle-Jiao"and"lower-Jiao"（Plt;0.05）."However，"there"was"a"notable"decrease"in"upper-Jiao"temperature"（Plt;0.05）."Metabolomics"analysis"identified"varying"levels"of"serum"metabolites"in"IGT"patients"with"Yang-deficiency"constitution，"such"as"4-acetylaminobutyric"acid，"3-dehydrocholic"acid，"citric"acid，"and"cystine"etc."16"metabolites."Treatment"group"exhibited"distinct"expression"patterns"for"16"metabolites"（including"diaminoheptadecic"acid，"acetyl-L-carnitine"and"monobutyl"phthalate"etc.）."The"analysis"by"MetaboAnalyst"shows"that"Yang-deficiency"constitution"with"IGT"was"linked"to"dysregulation"in"the"tricarboxylic"acid"cycle，"aminoacyl"bioanabolic"pathway，"and"Gly-Ser-Thr"metabolic"axis."Additionally，"Yanghe-patch"intervention"affects"the"glycine，"serine"and"threonine"（Gly-Ser-Thr）"metabolic"axis"and"sphingolipid"metabolism."Conclusion"The"application"of"Yanghe-patch"on"acupoints"shows"potential"in"alleviating"chronic"systemic"inflammation"and"improving"symptoms"associated"with"Yang-deficiency"constitution"in"individuals"with"IGT."Metabolomics"analysis"has"revealed"a"range"of"metabolites"involved"in"their"mechanism，"among"which"the"Gly-Ser-Thr"metabolic"pathway"is"considered"crucial"for"regulating"the"constitution"of"Yang-deficiency"constitution"in"individuals"with"IGT.

[Key"words]"Impaired"glucose"tolerance;"TCM"Constitution;"Acupoint"application;"Metabolomics;"Yanghe-patch;"Yang-"deficiency"constitution

近年来，糖尿病与糖尿病前期发病率逐年增加，其中糖耐量减低（impaired"glucose"tolerance，IGT）发病率已达18.6%[1]。IGT发病与多因素参与的机体代谢紊乱密切相关，生活方式干预及中医治疗均是有效防治手段，可预防或延缓其向糖尿病进展[2]。IGT患者由于禀赋不足、长期慢性亏耗等因素导致阳气亏损，阳虚体质高频出现[3]。阳和贴化裁自王维德《外科证治全生集》之阳和汤，可温阳补血、散寒通络，调节机体代谢。本研究以阳虚体质IGT患者为研究对象，采用目前在糖尿病等代谢性疾病研究[4]、中医体质内源性特征性标志物研究[5-6]中均有广泛应用的代谢组学方法，对涉及机体生命活动的多参数代谢产物采用液相色谱-质谱（liquid"chromatograph-mass"spectrometer，LC-MS）技术结合生物信息学方法分析，并引入红外线热成像技术，进行阳和贴穴位贴敷治疗效果评价及对人体血清代谢谱的影响，预测相关作用靶点，为中医外治法调护IGT偏颇体质提供理论依据。

1""资料与方法

1.1""一般资料

选取2022年10月至2024年1月于浙江中医药大学附属宁波市中医院就诊的25～65岁IGT患者，采用分层随机化法分为对照组和治疗组。根据公式：，P1=0.85，P2=0.45，设双侧α=0.05，治疗组与对照组样本量为1∶1；计算治疗组及对照组样本量均为32例，故本研究共纳入64例IGT患者。研究过程中治疗组脱落1例，脱落率lt;10%，最终治疗组31例，对照组32例。另选取同期29名健康体检者纳入健康组，作为差异代谢物分析时的阴性对照。治疗组中男16例，女15例，平均年龄（47.87±7.72）岁；对照组中男16例，女16例，平均年龄（48.34±7.08）岁；健康组中男15名，女14名，平均年龄（46.80±6.36）岁。三组纳入者的年龄、性别比较，差异无统计学意义（Pgt;0.05），具有可比性。本研究参与者均知情同意并签署知情同意书。本研究经浙江中医药大学附属宁波市中医院医学伦理委员会审批通过（伦理审批号：伦审2022研第018号-08）。

纳入标准：①符合IGT诊断标准：参照《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》[1]标准，空腹血糖（fasting"blood"glucose，FBG）lt;7.0mmol/L，口服葡萄糖耐量试验餐后2h血糖≥7.8且lt;11.1mmol/L，并排除1型糖尿病、单基因糖尿病、继发性糖尿病、妊娠糖尿病；②阳虚体质判定标准：根据《中医体质分类与判定》[7]标准计算原始分及转化分，判定体质类型；③健康人群评定标准：排除糖代谢异常病史，无代谢性疾病、心脑血管疾病、肝肾系统疾病及其他相关疾病，排除恶性肿瘤、免疫系统疾病、内分泌疾病、血液系统疾病等。排除标准：①各种应激状态如感染、创伤、大出血、严重心脑肾重症患者，各类代谢疾病急性并发症，其他兼症（如肿瘤、免疫系统或血液系统疾病）患者；②对研究药物中某种成分过敏或有不良反应者；③妊娠或哺乳期女性；④各类慢性病需长期使用西药控制者。剔除标准：①未按试验设计方案治疗；②治疗后产生不良反应未能接受全程观察者；③临床资料不全者。

1.2""研究方案

1.2.1""治疗方案""纳入者入组前均停用其他口服及外用药物（包括中药）14d，作为药物洗脱期。①生活方式基础治疗：治疗组和对照组患者均接受控糖饮食、运动指导；②治疗组患者加用阳和贴（白芥子20g，细辛20g，肉豆蔻20g，肉桂10g，干姜10g，生黄芪10g，冰片8g，本院制剂室统一粉碎，按5g药粉0.5ml姜汁+1.0ml蜂蜜配比混合成糊状，装入专用敷贴凹槽内）外敷于关元、气海、中脘、命门、脾俞（双侧）、肾俞（双侧）、足三里（双侧）穴，每次外敷90min，1次/周，持续治疗8周。

1.2.2""评价指标""治疗组和对照组患者均接受理化指标检查、中医体质评分测定，比较治疗前后变化情况；治疗组、对照组和健康组纳入者均行血清代谢组学测定。①理化指标：治疗组和对照组患者禁食12h后空腹采血4ml，生化法测FBG、总胆固醇（total"cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low-density"lipoprotein，LDL），酶联免疫吸附试验检测血清肿瘤坏死因子α（tumor"necrosis"factor-α，TNF-α）水平；另取血2ml以亲和层析微柱法测定糖化血红蛋白（hemoglobin"A1c，HbA1c）。②疗效评价标准：参照《中药新药临床研究指导原则》[8]相关判定原则。③阳虚体质评分：根据《中医体质分类与判定》[7]评分。④红外线热像测定：测试室维持室温（26±2）℃、湿度40%～60%，室内减少空气流动。受试者暴露观察的部位，采用数字式医用红外线热像仪（杭州远舟医疗科技有限公司，型号：MTI-Economy-2013-B）拍摄图片，IRM"View热成像图分析所测图像的人体功能分区（上焦、中焦、下焦）、任脉、督脉的相对温差ΔT值，ΔT=Ta–Tb（Ta为功能分区平均温度，Tb为躯干平均温度），正值为热偏离，负值为凉偏离。

1.2.3""LC-MS法测定血清代谢谱""采用Waters"ACQUITY超高效液相色谱和Termo"Scientifc"Q-Exactive高分辨质谱仪行代谢物的分离和检测。血清样本用甲醇提取后加入内标（1mg/ml二氯苯丙氨酸）5μl进行检测。色谱柱：ACQUITY"UPLC"HSS"T3（2.1mm×100mm，1.8μm）。色谱分离条件：柱温40℃；流速0.3ml/min；流动相A：水+0.05%甲酸；流动相B：乙腈；注射量：5μl；自动注射器温度：4℃。质谱参数：采用Q"Exactive"HF质谱仪进行一级、二级质谱数据采集，一级全扫描（扫描范围：70～1050m/z），数据依赖性二级质谱扫描（dd-MS2，TopN=10）。采用正、负离子模式进行检测。

1.2.4"方法学考察与数据分析""取10μl待测样本混合作为质控样本（quality"control，QC），在检测中均间隔10个样本插进1个QC，以观察仪器系统的重复性和稳定性。数据分析采用总离子电流归一化方法，将三维数据输入SIMCA"14.1软件进行主成分分析（principal"component"analysis，PCA），对潜在结构的正交投影-判别分析（orthogonal"projections"to"latent"structures-discriminate"analysis，OPLS-DA）获得更高水平的群体分离。对差异代谢物以Fold"change≥1.4或lt;0.8，且Plt;0.05作为初步筛选条件，结合变量权重值（variable"importance"in"the"projectio，VIP）gt;1.5、t检验结果Plt;0.05的条件，筛选具有显著差异性的代谢物。

1.3""统计学方法

采用IBM"SPSS"22.0统计学软件对数据进行处理分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组内治疗前后的比较采用配对样本t检验，两组之间比较采用独立样本t检验。计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，比较采用c2检验。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2""结果

2.1""两组患者的临床疗效比较

治疗组患者的总有效率90.32%高于对照组的46.88%，差异有统计学意义（Plt;0.05），见表1。

2.2""两组患者的阳虚体质评分与红外线热成像图温度特征比较

治疗后，治疗组患者的阳虚体质评分显著下降（Plt;0.05），对照组患者则无明显变化（Pgt;0.05）。治疗前两组患者的任脉温度较督脉低，符合阳虚偏颇体质中任督阴阳失衡的特征，督脉轨迹不规整连续，热偏离较少；上焦、中焦、下焦的温度ΔT值呈下降趋势，符合阳虚体质“上热下寒”特征[9-10]；两组患者的上述部位温度ΔT值比较，差异无统计学意义（Pgt;0.05）。治疗后，治疗组患者的任脉温度升高，凉偏离改善，督脉温度明显升高（Plt;0.05），督脉轨迹连续性增加；上焦温度下降（Plt;0.05），热偏离改善，中焦、下焦温度均出现明显升高（Plt;0.05），见表2和图1。

2.3""两组患者的理化指标比较

治疗后，治疗组患者的FPG、HbAlc、TG、LDL、TNF-α水平较治疗前均明显下降（Plt;0.05），且低于对照组（Plt;0.05）；两组患者治疗前后的TC水平均无明显变化（Pgt;0.05），见表3。

2.4""多元统计分析

对治疗组、对照组及健康组纳入者的血清进行代谢组学分析，所得数据通过无监督PCA分析及监督模式下的OPLS-DA分析降低数据维数。正离子模式下，健康组vs.对照组：R2X=0.243，R2Y=0.897，Q2=0.739；对照组vs.治疗组，R2X=0.199，R2Y=0.846，Q2=1.102。负离子模式下，健康组vs.对照组：R2X=0.294，R2Y=0.654，Q2=0.792；对照组vs.治疗组：R2X=0.195，R2Y=0.866，Q2=0.574。表明模型拟合度越好模型预测效能越高，见图2。

A.正离子模式下组间比较PCA得分图；B.负离子模式下组间比较PCA得分图；C.正离子模式下健康组vs.对照组OPLS-DA得分图；""""D.负离子模式下健康组vs.对照组OPLS-DA得分图；E.正离子模式下对照组vs.治疗组OPLS-DA得分图；F.负离子模式下对照组vs.治疗组OPLS-DA得分图

2.5""血清差异代谢物筛选

按OPLS-DA的VIP值结合t检验结果，在健康组vs.对照组间确定16个差异表达的代谢物；在对照组vs.治疗组间确定16个差异表达的代谢物，见表4。利用迈维云平台将组间差异代谢物的含量变化转化为可视化热图，见图3。

2.6""代谢通路初步分析

在MetaboAnalyst及KEGG数据库中对差异代谢物进行搜索与代谢通路分析。以通路影响值gt;0.1且Plt;0.05为筛选标准，健康组vs.对照组共得到3条阳虚体质IGT患者与健康人群的主要差异通路，对照组vs.治疗组共得到2条与阳和贴治疗阳虚体质IGT患者相关通路，见表5，其中甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸（glycine，serine"and"threonine，Gly-Ser-Thr）代谢轴相关通路在两组间比较中均被得到。

代谢组学是通过对机体代谢产物定性定量分析并经多维统计分析及资源整合了解代谢物功能作用的关键技术，在代谢性疾病机制研究中得到广泛应用[11]。目前代谢组学在中医体质学物质基础等研究中应用较多，弥补既往的基因组学研究侧重体现先天遗传作用而忽略后天因素导致变化的缺陷[12]。代谢物结合基因与环境共同作用，更贴近表型[13]；故以组学技术筛选代谢标志物群及相关通路，观察内源性代谢物谱的特征性改变可为疾病特定体质的物质基础提供鉴别依据。

阳虚则代谢减缓，作为IGT发病始动因素贯穿疾病始终[14]。针对阳虚体质IGT者，有研究以阳和汤治疗糖尿病周围神经病变，可改善局部血供，缓解冷痛、麻木[15]。本研究选用阳和贴外敷，重用白芥子、细辛散寒止痛，肉豆蔻温里祛寒，佐以肉桂、干姜温经通络，生黄芪益气温里，穴位贴敷取穴关元、气海、中脘、命门，培补元阳，配以脾俞、肾俞、足三里，补中益气。8周后，治疗组阳虚评分下降、症状改善，任脉偏寒及督脉“多段分层”等阴阳失衡表现减轻，“上焦偏热、中下焦偏寒”减轻，患者血糖、血脂水平均改善，血清炎症因子下降，表明阳和贴可调节阳虚体质IGT患者的糖脂代谢，减轻代谢紊乱引起的慢性炎症。

代谢组学分析显示，阳虚体质IGT患者血清中代谢物4-乙酰氨基丁酸、3-脱氢胆酸等升高，治疗组患者的二氨基庚二酸较对照组升高，胆红素较对照组下降。经MetaboAnalyst软件分析发现阳虚体质IGT形成与三羧酸循环、Gly-Ser-Thr代谢轴等通路有关，而Gly-Ser-Thr代谢轴与阳和贴干预也同样相关。肖雅等[16]针对阳虚体质亚健康人群血浆代谢组学的研究证实阳虚体质存在氨基酸代谢、三羧酸循环等通路改变，与本研究类似。Gly-Ser-Thr代谢轴参与机体抗衰老机制，通过激活解毒作用和维持分子周转、修复、合成，保持细胞活性[17]；这与阳虚体质IGT多发生在禀赋不足、高龄人群相符，且Gly-Ser-Thr轴相关途径如AMPK通路可通过影响碳水化合物模式和能量利用效率增加抗氧化作用[18]；与阳虚体质能量代谢障碍特点相符，故阳和贴可能通过上述机制调整能量代谢、改善阳虚症状。

综上，本研究通过糖类、脂质及炎症因子测定结合体质评分、红外线热成像技术完成阳和贴穴位贴敷治疗阳虚体质IGT患者效果评价，并对患者血清代谢标志物特征性变化作初步研究，观察到多个阳虚体质IGT的潜在代谢标志物及阳和贴干预的潜在作用靶代谢物，并预测Gly-Ser-Thr代谢轴相关通路可能是阳和贴干预作用的潜在作用通路。研究从内源性代谢物及通路出发，探讨穴位贴敷治疗阳虚体质IGT人群的血清代谢物变化，但所得研究结论仅为生信预测结果，具体作用机制与靶点尚需深入研究，本研究团队将在后续研究中通过构建代谢网络并结合网络药理学分析，以期发现潜在的干预靶点并进行进一步的细胞、组织水平验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2024–06–29）

（修回日期：2024–11–19）