高效液相色谱法测定山西老陈醋中川芎嗪的方法优化

摘 要：本试验对《地理标志产品 山西老陈醋》（GB/T 19777—2013）附录B中高效液相色谱法测定山西老陈醋中川芎嗪的方法进行优化，通过单因素试验和正交试验对样品处理过程中的溶液体系pH值、三氯甲烷用量、离心条件进行研究。最终确定使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节pH值至11.0，分别加入5 mL三氯甲烷萃取2次、于6 000 r·min-1下离心5 min的处理条件下测定效果最好，加标回收率为90.9%～93.8%，相对标准偏差为0.47%～1.19%，均可以满足山西老陈醋中川芎嗪的测定需求。

关键词：山西老陈醋；川芎嗪；高效液相色谱法

Optimization of High Performance Liquid Chromatography for Determination of Ligustrazine in Shanxi Aged Vinegar

XU Zhifang， ZHAO Yiru

（China Spectrum Testing Technology （Shanxi） Co.， Ltd.， Linfen 043000， China）

Abstract： This experiment optimized the method for determining ligustrazine in Shanxi aged vinegar by high-performance liquid chromatography in appendix B of GB/T 19777—2013. The pH value of the solution system， the amount of trichloromethane， and the centrifugation conditions during the sample processing were studied through single factor experiments and orthogonal experiments. Finally， it was determined to use sodium hydroxide solution （200 g·L-1） to adjust the pH to 11.0， extract twice with 5 mL of chloroform， and centrifuge at 6 000 r·min-1 for 5 min. The best results were obtained under the treatment conditions， with a standard recovery rate ranging from 90.9% to 93.8% and a relative standard deviation of 0.47% to 1.19%， all of which can meet the requirements for the determination of ligustrazine in Shanxi aged vinegar.

Keywords： Shanxi aged vinegar; ligustrazine; high-performance liquid chromatography

山西老陈醋是以高粱为主要原料，配以小米、豌豆、糯米、大米、小麦麸皮和苦荞麦等优质淀粉质粮食作物以及谷糠、稻壳等辅料经液化、糖化、酒精化和醋化多道工艺生产而成的具有独特风味的餐桌美味[1]。川芎嗪是山西老陈醋中的一种有益成分，具有改善人体心脑血管和微循环等功能，其主要来源于美拉德反应，含量与发酵水平、生产过程和陈放时间等因素有关[2]。研究表明，川芎嗪最早出现在醋酸发酵过程中，但该阶段的产生量很少，加热煎煮和密封陈放过程都能显著增加川芎嗪的含量，且随着陈放时间的延长，川芎嗪含量会持续增加，是山西老陈醋的特征指标之一[3-4]。《地理标志产品 山西老陈醋》（GB/T 19777—2013）附录B[5]中规定了山西老陈醋中川芎嗪的检测方法，但笔者在日常检验中发现该方法测定山西老陈醋的加标回收率较低（65%左右），基于此，本文对GB/T 19777—2013附录B中高效液相色谱法测定山西老陈醋中川芎嗪的方法进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

醋样：山西老陈醋（川芎嗪本底值19.25 mg·L-1）；盐酸川芎嗪标准品（批号110817-201608，含量以83.4%计，中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司）；三氯甲烷（优级纯，山东金岭化工股份有限公司）；盐酸（优级纯，成都市科隆化学品有限公司）；氢氧化钠（优级纯，天津市凯通化学试剂有限公司）；磷酸二氢铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

LC2030-D高效液相色谱仪（配DAD检测器），日本岛津公司；AUW120D电子天平（精度0.01 mg），梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；HC-3016R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；WH-861旋涡混合器，华利达实验设备有限公司；PHS-3E pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理方法

使用单标线移液管准确移取待测醋样10.00 mL于50 mL的离心管中，用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节pH值，加入一定量的三氯甲烷，涡旋混合2 min，使三氯甲烷与样品充分混匀，置于高速冷冻离心机中离心一定时间，转移三氯甲烷层；重复加入三氯甲烷提取，合并2次三氯甲烷层。然后加入4.5 mL盐酸溶液（0.2 mol·L-1）萃取，重复1次，合并水相，用一级水定容至10.00 mL，过0.45 μm滤膜待测。

1.3.2 方法条件优化单因素试验

（1）准确移取4份待测醋样，分别使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节pH值至8.5、9.0、10.0和11.0，加入5 mL三氯甲烷，于4 000 r·min下离心5 min，其他操作同1.3.1中，筛选适宜的溶液体系pH值。

（2）准确移取4份待测醋样，使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节至最适宜pH值，分别加入5 mL三氯甲烷萃取2次、加入10 mL三氯甲烷萃取1次、加入5 mL三氯甲烷萃取3次以及加入10 mL三氯甲烷萃取2次，于4 000 r·min-1下离心15 min，其他操作同1.3.1中，筛选适宜的三氯甲烷用量及萃取次数。

（3）准确移取4份待测醋样，使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节至最适宜pH值，一次或多次加入适宜的三氯甲烷，离心条件分别设置为4 000 r·min-1下离心5 min、4 000 r·min-1下离心15 min、6 000 r·min-1下离心5 min以及8 000 r·min-1下离心5 min，其他操作同1.3.1中，筛选最佳的离心条件。

1.3.3 方法条件优化正交试验

在单因素实验结果的基础上，以品牌山西老陈醋（川芎嗪本底值19.25 mg·L-1）为加标样品，每份样品加入300 μL浓度为1.0 mg·mL-1的川芎嗪标准溶液，按照3因素3水平正交试验表（见表1）中的方法条件进行处理，每个水平样品平行测定6次，计算6次平均测定结果的加标回收率。

1.4 液相色谱测定条件

色谱柱：GL Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：20 ℃；流动相：磷酸二氢铵（0.2 mmol·L-1）∶甲醇=6∶4；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL；DAD检测器波长：λ=279 nm。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 溶液体系pH值筛选

由图1可知，使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节醋样pH值至8.5，加入5 mL三氯甲烷，于4 000 r·min-1下离心15 min条件下，发现三氯甲烷与醋样无明显分层，故无法转移三氯甲烷层。使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节醋样pH值至9.0时，其他操作同上，发现三氯甲烷与醋样有分层，但有机层的体积约为0.5 mL。使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节醋样pH值＞10.0时，其他操作同上，发现三氯甲烷与醋样明显分层，有机层体积约3.0 mL，由此确定溶液体系的最佳pH值为10.0～11.0，正交试验中溶液体系pH值的3个水平选9.0、10.0、11.0。

2.1.2 三氯甲烷用量的确定

使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节醋样pH值至10.0，分别加入5 mL三氯甲烷萃取2次、加入10 mL三氯甲烷萃取1次、加入5 mL三氯甲烷萃取3次、加入10 mL三氯甲烷萃取2次，4份醋样均在4 000 r·min-1下离心15 min。经测试并计算得，山西老陈醋（本底值19.25 mg·L-1）中川芎嗪含量分别为16.14 mg·L-1、16.23 mg·L-1、16.24 mg·L-1、

15.51 mg·L-1，由于三氯甲烷为有毒有害试剂，综合考虑用量及回收率得出三氯甲烷最适宜用量为用5 mL三氯甲烷萃取2次，正交试验中三氯甲烷用量的3个水平为加入5 mL萃取2次、加入10 mL萃取1次、加入5 mL萃取3次。

2.1.3 离心条件的确定

使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节醋样pH值至10.0，分别加入5 mL三氯甲烷萃取2次，分别在离心条件为4 000 r·min-1下离心5 min、4 000 r·min-1下离心15 min、6 000 r·min-1下离心5 min、8 000 r·min-1的条件下离心5 min，发现三氯甲烷与醋样均明显分层，有机层体积分别为0.5 mL、3.0 mL、3.5 mL和3.0 mL，且8 000 r·min-1下离心5 min出现乳化。将处理过的4份醋样分别上机测定，计算得山西老陈醋（本底值19.25 mg·L-1）中川芎嗪含量分别为14.04 mg·L-1、16.24 mg·L-1、16.43 mg·L-1和15.88 mg·L-1，综合考虑萃取后分层状态及回收率得出最佳离心条件为6 000 r·min-1下离心5 min，正交试验中离心条件的3个水平为4 000 r·min-1下离心15 min、6 000 r·min-1下离心5 min、8 000 r·min-1下离心5 min。

2.2 正交试验结果分析

由表2中正交试验的结果可知，溶液体系pH值对测定结果的影响最大，其次为三氯甲烷用量，离心条件的影响较小。由k值得，正交试验的最优水平组合为A3B1C2，即使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节pH值至11.0，分别加入5 mL三氯甲烷萃取2次、于6 000 r·min-1下离心5 min的处理条件下加标回收效果最优。

2.3 优化方法的准确度与精密度测试

选择不同品牌、不同度数的3种山西老陈醋样品，分别加入200 μL浓度为1.0 mg·mL-1的川芎嗪标准溶液，采用2.2中正交试验筛选出的条件处理醋样，在1.4液相色谱条件下进行6次平行测定，计算6次平均测定结果的加标回收率及精密度（以相对标准偏差表示）。由表3可知，使用优化的方法条件进行醋样前处理，加标回收率为90.9%～93.8%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为0.47%～1.19%，准确度与精密度均可以满足山西老陈醋中川芎嗪测定的需求。

3 结论

本试验针对GB/T 19777—2013附录B中高效液相色谱法测定山西老陈醋中川芎嗪方法回收率较差的问题，使用单因素试验和正交试验对前处理条件进行优化，并使用优化后的方法条件对3种不同品牌、不同度数的山西老陈醋样品进行加标回收与精密度验证，得出使用氢氧化钠溶液（200 g·L-1）调节醋液pH值至11.0，分别加入5 mL三氯甲烷萃取2次、6 000 r·min-1下离心5 min，加标回收率为90.9%～93.8%，相对标准偏差为0.47%～1.19%。优化后的方法可将日常检验中川芎嗪的加标回收率由65%提升至90%以上，大大提高了山西老陈醋中川芎嗪测定的准确度，可以满足食醋企业和食品检验检测机构对山西老陈醋中川芎嗪的检测需求。

参考文献

[1]胡红娟.山西老陈醋酿造技艺[J].食品工程，2015（3）：18-20.

[2]朱丽，樊垚，曾泳艇，等.山西老陈醋中川芎嗪测定及特征分析研究[J].食品科技，2014，39（12）：294-298.

[3]王瑞，彭晓光，黄登宇.食醋中川芎嗪成分研究进展[J].中国调味品，2015，40（6）：137-140.

[4]巩丽青，韩顺林，赵芳，等.山西老陈醋酿造过程中川芎嗪的分析测定[J].中国调味品，2018，43（8）：135-138.

[5]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.地理标志产品 山西老陈醋：GB/T 19777—2013[S].北京：中国标准出版社，2013.