基于逆向网络药理学探讨绝经后骨质疏松病机及中药组方预测

[摘要] 目的 探讨绝经后骨质疏松的发病机制，并基于逆向网络药理学进行靶点和中药成分的分子对接验证及中药组方预测。方法利用韦恩图提取并展示“骨质疏松”与“绝经后”的共有靶点；对提取的共有靶点进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析；构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络以明确绝经后骨质疏松的发病机制、通路和关键靶点，最终构建关键靶点-有效成分-中药网络，确定度值较高的中药并整理其性、味、归经。结果针对绝经后骨质疏松，保留度值≥10的17个可匹配中药成分的关键靶点，于中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）中匹配中药成分信息，以度值最高的3个靶点与度值≥5且口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18的6种中药成分进行18次分子对接验证，结果稳定且良好。逆向收集300种中药，其中度值≥4的52种中药以寒性药、苦味药居多；在归经上，以肝、肺经居多；在功效上，以活血化瘀居多。结论运用逆向网络药理学思维及分子对接技术对绝经后骨质疏松进行靶点、通路、成分和中药预测；结合临床实践，在辨证论治绝经后骨质疏松治疗中适当加入苦寒、归肝肺经、活血化瘀类药物并适当添加银杏叶、菟丝子、鸡血藤、甘草、黄芪等中药以改善关节炎症、抑制破骨细胞分化、促进成骨细胞分化、预防骨质疏松，为今后临床辨证论治中药组方拓宽思路。

[关键词] 逆向网络药理学；绝经后骨质疏松；发病机制；分子对接；中药组方

[中图分类号] R22；R25；R287[文献标识码] A [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.27.019

Exploring the pathogenesis of postmenopausal osteoporosis and predicting traditional Chinese medicine prescriptions based on reverse network pharmacology

Internal Department ofTraditional Chinese Medicine， YuyaoHospital of T.C.M， Yuyao315400， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To discussthe pathogenesis of postmenopausal osteoporosis， and to validate molecular docking and predict the composition of traditional Chinese medicine based on reverse network pharmacological. MethodsThe shared targets of “osteoporosis” and “postmenopausal” were extracted and demonstrated by using Venn diagram. The common targets were analyzed for gene ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment. The protein-protein interaction （PPI） network was constructed to clarify the pathogenesis， pathways and key targets of postmenopausal osteoporosis， and finally the key target-active ingredient-traditional Chinese medicine network was constructed， and the characteristics， taste and tropism of traditional Chinese medicines with high identification values were sorted out. ResultsFor postmenopausal osteoporosis， 17 key targets of which degree value≥10 that could match with traditional Chinese medicines were analysis in traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP）， and the resultsof 18 times of molecular docking tests werestable and good which performed onthe highest degree value 3 targets with 6 traditional Chinese medicines components （degree value≥5，oral bioavailability≥30%，drug likeness≥0.18）.Collected 52 kinds of traditional Chinese medicines （degree value≥4） were mainly cold and bitter，belonging to liver and lung channels in channel tropism，promoting blood circulation and removing blood stasis in efficacy from 300 kinds of traditional Chinese medicines. Conclusion In this study，the targets， pathways， compositionsand prescriptionswere predicted for postmenopausal osteoporosis based on reverse network pharmacological and molecular docking.However，the thinking be broadening for the formulation of traditional Chinese medicinewhich appropriately added bitter cold drugs、drugs entering liver and lung channels， blood-activating and blood-stasis removing drugs and high-value Chinese medicines such as ， ， ， and to improve joint inflammation， inhibit osteoclast differentiation， promote osteoblast differentiation and prevent osteoporosis for the treatment of postmenopausal osteoporosis.

[Key words]Reverse network pharmacology; Postmenopausal osteoporosis; Pathogenesis; Molecular docking; Chinese medicine formulation

绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指女性绝经后雌激素水平降低，骨吸收功能增强，骨量减少，骨微结构受到破坏，进而导致骨重建平衡失调的代谢性骨病，患者可出现疼痛、脊柱急性/压缩性骨折，甚至多脏器功能衰竭等，严重影响女性身心健康，甚至危及生命^[1]。PMOP是一种多危险因素疾病，目前其发病机制尚未完全明确，治疗方式单一，不良反应较大。近年来，中医药防治PMOP的相关研究不断深入。大量研究及临床经验认为，中医药可在取得临床疗效的同时，有效规避主流治疗方法带来的不良反应，显示其独特优势。本研究基于逆向网络药理学，从疾病的关键靶点出发，寻找对应的中药成分，再由中药成分寻找具体中药，对PMOP的中药组方进行预测，为中药组方的精确制定提供新思路。

1 材料与方法

1.1获取骨质疏松与绝经后的共有靶点

在基因名片（GeneCards）数据库中分别获取“osteoporosis”和“postmenopausal”的靶点，保留相关性评分≥3.0的靶点，通过韦恩图提取并展示二者的共有靶点。

1.2 共有靶点的富集分析

将上述提取的共有靶点导入Metascape进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，明确发病机制和通路。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络

将上述共有靶点导入String平台构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并运用Cytoscape软件计算度值，用于确定度值较高的关键靶点。

1.4 自关键靶点逆向收集中药成分

将关键靶点基因名称输入UniProt数据库进行检索并进行名称转换，再将转换后的靶点蛋白输入中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）检索，找出与靶点蛋白相关联的中药成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18为条件进行筛选。

1.5 关键靶点和中药有效成分的分子对接验证

将上述所得关键靶点和中药有效成分输入蛋白结构数据库进行检索，下载化学结构用以分子对接，运用Discovery Studio软件将中药成分结构与靶点结构进行分子对接，其匹配程度以热能表示，以此为依据，应用热图展示关键靶点和有效成分的结合程度。

1.6 构建关键靶点-有效成分-中药网络

于TCMSP中由有效成分逆向收集中药有效成分，最终构建关键靶点-有效成分-中药网络。

1.7中药性、味、归经分析

参照2020版《中华人民共和国药典》^[2]与《中药学》^[3]“十三五”规划教材，整理度值较高中药的性、味、归经，并绘制雷达图。

2 结果

2.1“骨质疏松”与“绝经后”共有靶点

于GeneCards数据库获取“osteoporosis”靶点5741个，保留504个度值≥3的靶点；获取“postmenopausal”靶点1870个，保留222个度值≥3的靶点；二者交集后获取“osteoporosis”与“postmenopausal”共有靶点182个，见图1。

2.2 GO/KEGG富集分析

将获得的182个共有靶点输入Metascape平台进行基因富集功能分析以明确发病机制与通路，见图2和图3。得出<0.01、计数>3的生物过程共20个，主要包括激素作用、成骨作用、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路调控、骨骼系统发育等。KEGG富集分析的前20个通路主要包括肿瘤信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、晚期糖基化终末化产物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化终末产物受体（receptor for dvanced glycation end prod-ucts，RAGE）信号通路在糖尿病并发症中的作用、类风湿关节炎、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称Akt）信号通路等。

2.3构建PPI网络

将由韦恩图得到的182个共有靶点输入String

数据库，得出由168个节点、409条边构成的PPI网络图；用Cytoscape软件计算各节点度值，以度值为标准，得出更具可视化的网络图（度值越大，颜色越深，圆圈越大），见图4。

在上述靶点中，保留度值≥10的26个靶点；将26个靶点基因转换为靶点蛋白后，共有17个靶点可匹配中药成分，最终取度值最高的3个靶点，见表1。

2.4 中药有效成分筛选与关键靶点-有效成分作用网络构建

2.4.1 中药有效成分筛选 在TCMSP数据库中，17个关键靶点共匹配到164个中药成分信息，用Cytoscape软件绘制网络图，并计算各节点度值。收集可匹配的中药成分，将OB≥30%且DL≥0.18设置为条件进行筛选后，度值≥1，匹配到44种有意义的中药成分，最终取度值最高的6种中药成分，见表2。

2.4.2 关键靶点-有效成分作用网络构建 为更清晰地展示关键靶点与中药有效成分之间存在的密切联系，将17个关键靶点共匹配到的44个有意义的中药成分用Cytoscape软件绘制网络图，见图5。

2.5分子对接验证

由表1中的度值2可知，排名前3的作用靶点分别为白细胞介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β。由表2可知，排名前6位的中药成分为槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、木犀草素、漆黄素、汉黄芩素、雷公藤甲素，预示这3个靶点和6个中药成分在“绝经后”和“骨质疏松”中研究价值相对较高。为进一步验证关键靶点-有效成分网络的可靠性，以关键靶点IL-6、TNF-α、IL-1β与6种中药成分分别进行18次分子对接，结果见图6所示，颜色越深，结合能越低，二者越容易结合。3个靶点对接结果较好的组合分别是IL-6-MOL013179、IL-6-MOL 000173、IL-1β-MOL000173、TNF-α-MOL000098、TNF-α-MOL006821、TNF-α-MOL000006、TNF-α- MOL013179、TNF-α-MOL000173、TNF-α-MOL 003187，结合能均<–8kcal/mol，上述9对分子对接结合稳定、活性较好，其可视化操作展示见图7。

2.6中药有效成分-中药作用网络构建与中药组方的预测

于TCMSP中收集44种有效成分来源的中药信息，共收集到300种中药，构建靶点-中药化合物-中药网络图。其中，度值≥5的中药分别为苦参、银杏叶、山豆根、白果、半枝莲、布渣叶、甘草、葛花、荷叶、胡芦巴、黄芪、金荞麦、连翘、木蝴蝶、枇杷叶、沙棘、菟丝子、余甘子、鸡血藤，提示其可能在PMOP治疗中发挥重要作用，见图8。

2.7 中药性、味、归经分析

整理度值≥4的52种中药的性、味、归经，药物的药性、药味、归经和功效见图9。寒性药、苦味药居多，其次为温性药、辛味药和甘味药；在归经上，肝、肺经居多，其次脾胃经；在功效上，以活血化瘀居多，利水渗湿次之。

3讨论

_{BxyeEHHmZk7nwOVUUczAtoN9t8ZFQ/5huSvrrGYhHkc=}PMOP严重危害中老年女性健康，降低生活质量，致残率和致死率高。调查显示，PMOP患者发生骨折的风险已超女性三大肿瘤患病率之和，可见PMOP防治刻不容缓^[4]。目前，中医药治疗PMOP取得显著效果，但其机制不明。因此，本研究运用逆向网络药理学思路及分子对接技术对其发病机制、关键靶点及中药有效成分进行深度分析和探索，为临床治疗提供新的思路。

3.1绝经后骨质疏松的相关靶点

研究显示TNF-α、IL-6、IL-1β与PMOP相关。TNF-α在分子对接结果中热能均<–20kcal/mol，提示TNF-α与PMOP的发病具有较强的相关性。TNF-α作为免疫系统和骨骼系统共有的细胞因子之一，可激活免疫细胞，导致炎症因子分泌，加重炎症；直接或间接促进骨吸收，通过多环节调节PMOP的发生发展；TNF-α是目前治疗PMOP的关键药物靶点之一，可作为监测PMOP进展的重要指标^[5]。部分学者认为TNF-α主要通过调节炎症反应、氧化应激和免疫反应途径，促进破骨细胞的分化、成骨细胞的形成，调控骨代谢；调节免疫细胞的分化和增殖，参与PMOP的发生发展^[6-8]。

IL-6是调节宿主免疫应答、炎症、肿瘤发生的多效细胞因子，也是免疫系统与神经内分泌系统之间的重要介质，可调节成骨和破骨过程，参与PMOP的致病过程。研究证实IL-6是由骨髓脂肪细胞分泌的一种细胞因子，可增加破骨细胞的形成和骨吸收，从而降低机体的骨密度^[9-10]。IL-1β是PMOP发生发展的重要环节，其不仅诱导破骨细胞分化因子RANKL的表达促进骨吸收过程，还可通过抗凋亡作用促进破骨细胞活性^[11-12]。

3.2 PMOP相关通路

富集分析显示，除激素和成骨作用等传统途径外，MAPK信号通路调控与PMOP的相关性最强。富集分析和分子对接结果显示，中药有效成分可通过MAPK信号通路和TNF-α、IL-6、IL-1β等细胞因子参与并调节PMOP的致病过程。

在骨吸收过程中，MAPK信号通路的激活可实现骨吸收功能；同时，TNF-α、IL-6或IL-1等也可激活MAPK信号通路，进一步促进破骨细胞的分化、增殖和成熟。PMOP的发展与机体免疫微环境中炎症状态密切相关，包括IL-6、TNF-α、IL-1β在内的促炎因子与骨代谢的状态变化密切相关，其水平增加可影响RANKL的表达，而RANKL表达水平升高可影响MAPK信号通路，从而调节破骨细胞的骨吸收作用^[13]。有研究指出，RANKL受影响后可发生磷酸化并激活胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p38、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）三类MAPK，抑制ERK1/2、p38MAPK、JNK可有效减少破骨细胞成熟和骨吸收^[14]。MAPK信号通路是PMOP致病的关键靶点之一，中药有效成分可能通过ERK/JNK/P38 MAPK信号通路和TNF-α、IL-6、IL-1β等细胞因子作用于PMOP。

3.3 关键中药有效成分和中药组方预测

本研究显示，由关键靶点逆向寻找到44种中药有效成分。槲皮素可抗炎、抗氧化、抗纤维化，甚至可介导MAPK信号通路，防止骨质疏松的发生^[15]。没食子儿茶素没食子酸酯可促进成骨细胞增殖，调节骨向分化^[16]。木犀草素可调控骨形成和骨丢失^[17]。漆黄素具有清除衰老细胞、促进成骨细胞分化、保护成骨细胞、抑制破骨细胞分化的作用^[18]。汉黄芩素可减轻免疫应答所致的炎症反应和促进骨折愈合^[19]。雷公藤甲素具有抗增殖和免疫抑制、减轻炎症损伤的作用^[20]。

从中药成分逆向收集到300种中药，构建靶点-中药成分-中药网络图，其中度值≥4的中药以寒性药、苦味药居多；在归经上肝、肺经居多；在功效上，以活血化瘀居多。根据现代药理学，在度值≥5的19种中药中，银杏叶、甘草、黄芪、菟丝子、鸡血藤具有改善关节炎症、抑制破骨细胞分化、促进成骨细胞分化、预防骨质疏松的作用^[21-25]。此外，在临床遣方用药中常用菟丝子、鸡血藤补益肝肾，活血化瘀；甘草、黄芪益气健脾，升阳举陷^[26]。但在筛选出的中药中3种度值最高的中药分别是苦参、银杏叶、山豆根，并非临床实践常用药物，可见度值与疾病具有相关性，但并非绝对相关，仍需利用分子对接技术或体外试验加以验证。

综上所述，通过中药预测结合文献查阅可在辨证论治PMOP治疗中适当加入苦寒、肝肺归经、活血化瘀类药并适当添加银杏叶、菟丝子、鸡血藤、甘草、黄芪等中药以改善关节炎症，抑制破骨细胞分化、促进成骨细胞分化，预防骨质疏松。本研究可为今后临床组方拓宽思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] BLACKiNhR5duj5esTUgBVsuvMrA== D M， ROSEN C J. Clinical practice. Postmenopausal osteoporosis[J]. N Engl J Med， 2016， 374（3）： 254–262.

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典： 一部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2020.

[3] 高学敏. 中药学（上册）[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2000.

[4] 衡燕， 张凯迪， 王新玲， 等. 校正FRAX在2型糖尿病中的干预阈值及应用价值[J]. 中国骨质疏松杂志， 2023， 29（6）： 852–857， 863.

[5] 姚娜， 李鹏程， 耿春梅， 等. TNF-α介导绝经后骨质疏松症发病机制的研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志， 2021， 27（3）： 454–458.

[6] 常志芳， 冯成龙， 史晓霞， 等. 免疫与骨质疏松的研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志， 2015， 21（4）： 508–513.

[7] 夏婷， 李双庆. 炎症相关骨质疏松症的发病机制[J]. 中国骨质疏松杂志， 2015， 21（1）： 117–120.

[8] 彭涛， 李爱国， 何培亮. 绝经后骨质疏松与氧化应激相关研究进展[J]. 中外医学研究， 2020， 18（10）： 186–188.

[9] DING J， NAGAI K， WOO J T， et al. Insulin-dependent adipogenesis in stromal ST₂cells derived from murine bone marrow[J]. Biosci Biotechnol Biochem， 2003， 67（2）： 314–321.

[10] KONG J， LI Y C. Molecular mechanism of 1， 25-dihydroxyvitamin D₃inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 cells[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2006， 290（5）： E916–E924.

[11] 刘静， 姜明霞. 炎症细胞因子IL-1β和IL-6在老年2型糖尿病合并骨质疏松患者血清中的表达及临床意义[J]. 中国老年学杂志， 2024， 44（3）： 590–593.

[12] JULES J， FENG X. In vitro investigation of the roles of the proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and interleukin-1 in murine osteoclastogenesis[J]. Methods Mol Biol， 2014， 1155： 109–123.

[13] KOBAYASHI-SUN J， SUZUKI N， HATTORI A， et al. Melatonin suppresses both osteoblast and osteoclast differentiation through repression of epidermal Erk signaling in the zebrafish scale[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2020， 530（4）： 644–650.

[14] 陈泽群， 朱文雄， 江铭， 等. 艾塞那肽通过p38-MAPK通路对成骨细胞促增殖和抗凋亡的作用研究[J]. 中国骨质疏松杂志， 2020， 26（6）： 869–871， 880.

[15] 袁可馨， 谢兴文， 李鼎鹏， 等. 槲皮素介导MAPK信号通路防治骨质疏松的研究现状[J]. 中国临床药理学杂志， 2024， 40（9）： 1375–1379.

[16] 彭岳文. 表没食子儿茶素没食子酸酯促进成骨细胞增殖及骨向分化的研究[D]. 广州： 南方医科大学， 2017.

[17] 许勇， 谢贤斐， 颜威， 等. 木犀草素调控PI3K/AKT通路改善绝经后骨质疏松症大鼠模型骨丢失的机制[J]. 热带医学杂志， 2022， 22（5）： 639–643， 688， 封4.

YfpYUSlWhsaOF5jOh3aXU9jby2pkerYp3uSYBeIWHAs=[18] 杨宇航， 陈嘉明， 王世坤， 等. 漆黄素治疗骨质疏松症作用机制的研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志， 2024， 30（1）： 81–86.

[19] 李庆贵， 陈康， 郭召， 等. 汉黄芩素调节MAPK/SIRT1信号通路对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响[J]. 实用医学杂志， 2023， 39（4）： 410–416.

[20] 高玉菊， 李留成， 许亮， 等. 中药活性成分抗肺纤维化及机制研究概况[J]. 中医药临床杂志， 2018， 30（2）： 183–190.

[21] 王坤， 任刘宝， 李威， 等. 银杏叶提取物治疗绝经后大鼠骨质疏松的实验研究[J]. 中国医药导报， 2016， 13（34）： 38–41， 封4.

[22] 邢如温， 李双进. 甘草素对乳腺癌内分泌治疗后继发性骨质疏松大鼠Wnt/β-catenin信号通路作用的研究[J]. 世界中西医结合杂志， 2023， 18（8）： 1566–1574.

[23] 胡勇， 张惜燕， 吴雪. 黄芪干预骨质疏松症的实验研究进展[J]. 现代中医药， 2023， 43（6）： 8–12.

[24] 孟卓然， 赵梓铭， 贾壮壮， 等. 菟丝子乙醇提取物灌胃对大鼠绝经后骨质疏松症的改善作用及其机制[J]. 山东医药， 2024， 64（17）： 29–32.

[25] 丁徐， 赵毅， 黄涛， 等. 鸡血藤对骨质疏松性骨折大鼠内固定术后恢复的作用及机制[J]. 西部医学， 2021， 33（6）： 813–817.

[26] 鲁志林， 陈继东， 周广文， 等. 名中医向楠补肾化痰方治疗绝经后骨质疏松症经验[J]. 陕西中医， 2024， 45（5）： 687–690.

（收稿日期：2024–06–29）

（修回日期：2024–09–05）