NIPT的不同测序深度对胎儿拷贝数变异及性染色体非整倍体检测效能的影响

[摘要] 无创产前筛查（noninvasive prenatal testing，NIPT）利用高通量测序技术检测母体血浆中的胎儿游离DNA片段，再经过生物信息学分析，最终评估胎儿存在染色体病的风险。目前主要用于筛查21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征。研究证实提升NIPT测序深度可拓宽疾病的覆盖范围并提升目标疾病的检测效能，NIPT显示出极大的临床应用前景。本文就NIPT的不同测序深度对胎儿拷贝数变异、性染色体非整倍体检测效能的影响进行综述，以期达到临床医生和患者可根据实际情况需要选择NIPT的不同测序深度，使NIPT更好地为产前筛查领域服务的目的。

[关键词] 无创产前筛查；测序深度；拷贝数变异；性染色体病；检测效能

[中图分类号] R169 [文献标识码] A [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.27.031

染色体数目异常、致病性基因组拷贝数变异（copy number variation，CNV）、染色体大片段缺失/重复及单基因病等染色体病是出生缺陷最常见的遗传因素之一^[1]。由于目前尚无有效治疗染色体病的方法，产前筛查和产前诊断成为有效降低出生缺陷发生率的重要防线。美国妇产科医师学会和国际产前诊断医师协会强调无创产前筛查（noninvasive prenatal testing，NIPT）可提供一种比羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样更安全的方法，用于筛查与严重畸形和神经系统改变相关的染色体异常。临床已证实NIPT对胎儿21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征筛查的特异性和敏感度均在99%以上^[2]；但其对CNV和性染色体非整倍体的检测效能仍不理想。为此，研究者一直致力于探索提高NIPT检测效能的方法。Lo等^[3]提出NIPT对一些染色体病的常规应用因其对测序深度的要求而受到限制。吕虹等^[4]认为升级测序技术流程、优化生物信息分析算法和文库构建、高精度收集胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）、增加全基因组的覆盖深度，可进一步提升 NIPT 的检测效能。本文主要从NIPT的不同测序深度对筛查胎儿CNV和性染色体非整倍体检测效能的影响进行综述。

1 NIPT概述

自2011年NIPT进入临床至今发展迅速，源于其与传统血清学相比突出的检测效能。妊娠中期血清学筛查敏感度为60%～70%，特别是对高龄孕妇的假阳性率高达20%^[5]。Demko等^[6]研究发现NIPT对常见染色体非整倍体筛查的假阳性率分别为0.1%、0.5%、0.3%，与传统血清学筛查的假阳性率（分别为4.5%、4.2%、4.4%）相比优势明显。谢清华等^[7]研究表明NIPT对常见染色体非整倍体的复合检出率和复合阳性预测值均优于传统血清学筛查。值得一提的是，NIPT对单胎21-三体综合征的敏感度高达99%，在准确性方面接近传统产前诊断水平^[8]。

年龄作为孕妇怀有21-三体综合征胎儿的主要高风险因素，也是影响传统血清学筛查和NIPT检测效能的主要因素。对高风险人群（≥35岁）而言，NIPT筛查21-三体综合征的检出率为99.7%，而妊娠中期血清学筛查为80%，妊娠早期联合筛查为90%^[9]。当传统血清学筛查呈高风险时，胎儿21-三体综合征的可能性为2%～4%；NIPT筛查呈高风险时，胎儿21-三体综合征的可能性达90%^[10]。尽管中国《母婴保健法》仍推荐高龄孕妇进行传统介入性产前诊断，但NIPT凭借其可使98%的高龄孕妇避免有创检查的优势更易被接受^[11]。此外，胎儿非整倍体的患病率随母亲年龄的增长而增加，所以在低风险女性（<35岁）中，NIPT筛查常见胎儿非整倍体的阳性预测值（positive predictive value，PPV）有所下降。但与传统血清学筛查比较NIPT的PPV仍高出10倍，同时假阳性率降低约100倍^[12]。综上，NIPT成为临床医生和患者都青睐的筛查方法。

鉴于NIPT评估常见胎儿非整倍体的成功应用，研究者一直探索将其检测范围扩大到其他染色体异常，结果显示检测效能良好。扩展性无创产前筛查（noninvasive prenatal testingplus，NIPT-plus）即通过加大测序深度实现在筛查21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征的同时，筛查性染色体病及部分较大片段的CNV。此外，NIPT 对单基因病也显示出广阔的应用前景和临床价值。未来随着cffDNA研究的不断深入，NIPT应用范围可扩展到Rh D血型鉴定、产科并发症的预测与管理等多个领域^[13]。

2 NIPT检测CNV

CNV是DNA片段层面上的缺失或重复，其长度通常>50bp，常表现为亚显微水平的基因组片段缺失或重复，在人类基因组中普遍存在。其中致病性CNV在正常人群中的发病率可达1.0%～1.7%，远高于21-三体综合征的发病率^[14]。染色体微缺失微重复综合征（chromosome microdeletion microduplicationsyndrome，MMS）可导致胎儿身体和（或）智力损伤，其严重程度可能大于整条染色体异常。与染色体非整倍体不同，胎儿CNV的发生与母亲年龄无关，且常规产前筛查较难发现。虽然小部分CNV可通过超声早期发现，但大部分仍被漏诊。因此临床需高度重视此类染色体病。目前，染色体微阵列是诊断CNV的金标准，但检测费用较高且采样时具有一定的侵入性，研究者致力于研发一种兼具安全性、高效性、经济性和快捷性的新型CNV 检测技术。

2.1 常规测序深度下NIPT对CNV的检测效能

自2011年首次证实 NIPT可用于检测胎儿CNV以来，NIPT检测CNV一直是产前筛查领域研究的热点。但NIPT对CNV 的检测效能并不理想、PPV 很低的问题一直存在。即使NIPT筛查迪格奥尔格综合征、猫叫综合征、1p36缺失综合征、普拉德-威利综合征/快乐木偶综合征这些胎儿最常见的MMS，其总体PPV仅为13%，与这些疾病的患病率低有关^[15]。此外，NIPT对CNV的筛查效果与CNV片段大小密切相关。在常规测序深度下，NIPT对CNV具有中等PPV，特别是对>5Mb的 CNV，NIPT可更准确地检测^[16]。尽管NIPT检测CNV的PPV不太理想，但Wapner 等^[17]认为 NIPT 对CNV具有很高的阴性预测值。基于此，研究者提出使用更深层次的测序或更高密度的单核苷酸多态性检测以提高对CNV的检测效能^[18]。

2.2 增加测序深度后NIPT对CNV的检测效能

研究者通过加大测序深度，改良生物信息分析算法提升NIPT对CNV的筛查效能。Liang等^[19]发现NIPT-plus预测迪格奥尔格综合征的阳性预测值高达92.9%，接近于21-三体综合征的95%阳性预测值，且对普拉德-威利综合征/快乐木偶综合征和染色体22q11.2缺失综合征也表现出较高的检测效能，对MMS筛查特异性>99%，因此推荐NIPT-plus结合超声作为一线筛查方法。2021年，Yang等^[20]对测序深度0.15×和0.4×进行对比分析显示，在检测MMS方面0.4×的测序深度可显著提高检出率和阳性预测值。此外，一项对37002名妊娠早期超声扫描不明显的孕妇行NIPT与NIPT-plus检测的研究表明NIPT-plus对妊娠早期经超声筛查未发现异常的MMS胎儿具有潜在临床应用价值，并建议NIPT-plus、超声、遗传咨询三者共同作为一种全方位的筛查方法适用于所有孕妇^[21]。刘雅贤等^[22]研究显示增加测序深度对降低NIPT假阳性率及罕见常染色体非整倍体漏检率有一定作用。但也有学者认为尽管NIPT-plus检测CNV较NIPT检出率更高，但两者PPV并无统计学差异，推测原因可能与提高测序样本量、加大测序数据量和优化生物信息算法有关^[4]。由于数据不足，日后仍需大规模的临床验证研究。

2.3其他

除测序深度外，NIPT对 CNV的检测效能还受CNV 的大小及cffDNA浓度等因素的影响。因此一些研究采用目标捕获富集方法和多样化的计算方法进行检测，但这也显著增加检测成本^[23]。国际产前诊断协会指出，NIPT的应用范围仅限于具有重大临床意义的疾病或定义明确的严重疾病，对临床意义尚未明确的CNV而言，在结果判读和临床处理方面可能会面临一定的挑战^[24]。

3 NIPT检测性染色体非整倍体

性染色体异常（sex chromosome abnormality，SCA）指性染色体X或性染色体Y在结构或数量上异常，包括Turner综合征（45，X）、超雌综合征（47，XXX ）、Klinefelter 综合征（47，XXY，48，XXYY），超雄综合征（47，XYY）和嵌合体等，总患病率为1/500，比常见染色体非整倍体更常见^[25]。SCA 的临床表现差异较大，其中性器官发育受阻、性腺功能减退及不育或不孕是较为普遍的临床表现，也可无异常表现。传统的非整倍体筛查方法，如母亲年龄、超声和生物标志物等无法有效识别性染色体非整倍体，特纳综合征除外，因该病可能表现为水囊瘤。此外，其他产前筛查对SCA的特异度较低bo2YH3+lBsmrim3XYx8Me12nFbJ/FTZN2x8UthBJ/uM=。因此，有研究者认为NIPT是筛查SCA的唯一方法^[26]。

3.1_{bo2YH3+lBsmrim3XYx8Me12nFbJ/FTZN2x8UthBJ/uM=} 常规测序深度下NIPT对 SCA的检测效能

NIPT 筛查胎儿性染色体病具有一定价值，但其准确性一直存在争议且具有以下特点：第一，NIPT在性染色体三体患者中的PPV较高，但其在X染色体减少的患者中较低^[27-28]。Wang等^[29]研究显示NIPT检测4种异常核型（45，XO/47，XXX/47，XXY/47，XYY）的 PPV 分别为29.73%、100.00%、81.82%和75.00%，可见与其他类型SCA比较NIPT对X单体的预测没有那么准确。第二，SCA发生在X染色体还是Y染色体对NIPT的检测效能似乎也有影响。Bevilacqua等^[30]研究表明SCA涉及X染色体的PPV低于涉及Y染色体的PPV。虽然NIPT筛查各类SCA的假阳性率差异较大，研究者仍认为NIPT是SCA特别是性染色体三体和SCA嵌合体的重要产前筛查方法。但具体的SCA类型和是否疑似母体SCA等信息有助于指导遗传咨询和临床处理^[31]。

3.2 增加测序深度后NIPT对SCA的检测效能

NIPT-plus 检测SCA的特异性高于NIPT^[32]。但SCA的固有复杂性为准确和可靠进行检测带来挑战，包括X 染色体上GC 含量的偏差、X 染色体的随机失活、X 与Y 染色体的高度同源性及Y 染色体与其他染色体相似的诸多片段^[33]。数据显示NIPT-plus检测SCA的总体阳性预测值为26.54%，4种异常核型（45，XO/47，XXX/47，XYY/47，XXY）的PPV分别为12.63%、33.33%、100.00%、51.52%^[34]。与常规测序深度下检测SCA的PPV相比并无明显提高。吕虹等^[4]对比NIPT与NIPT-plus检测SCA的分析显示4种异常核型（45，XO/47，XXX/47，XXY/47，XYY）阳性预测值之间的差异无统计学意义。因此，增加测序深度对提高NIPT筛查SCA的检测效能可能不如筛查CNV那么理想。

3.3 其他

综上，NIPT对SCA（尤其是X单体）的检出率较差且假阳性率高于其他染色体三体。从生物学因素分析，导致高假阳性率的潜在原因包括母源性染色体畸变、高龄女性X染色体的生物学丢失、双胎之一停育及胎盘嵌合体等^[35]。从NITP检测原理及过程角度来看，母血中胎儿DNA含量低、无法将母源性游离DNA和胎源性游离DNA完全分离、鸟嘌呤和胞嘧啶的测序偏差等均可导致NIPT检测结果与产前诊断结果不一致^[28]。基于目前研究数据，NIPT测序深度的增加并未显著提高SCA检测的PPV。因此未来是否有必要进一步增加测序深度仍值得探索。张丽娜等^[36]研究显示NIPT结果高风险已成为最常见的进行介入性产前诊断的指征，也是性染色体三体确诊最可靠的依据。此外，由于SCA的临床表现在个体间具有多样性，并非所有SCA患者均表现出明显症状，因此是否将其纳入NIPT筛查范围存在一定争议。但NIPT检测SCA的潜在优势是可在出生后早期进行干预并改善神经发育的结果^[37]。

4 NIPT在其他方面的应用SMTdAeb2fNa4Xlq6gNW7iTlVCdmaO1ojjM+ku5KZWZI=进展

研究显示NIPT在检测单基因病方面有良好的前景，如X‐连锁遗传病、β地中海贫血、囊性纤维化、强直性肌营养不良等^[38]。同时，NIPT也逐渐成为体外受精的理想筛查方法。Wei等^[39]研究表明NIPT在自然妊娠和体外受精妊娠中筛查染色体非整倍体均具有较高的敏感度及特异性。此外，NIPT还有望预测母体相关疾病，包括妊娠相关疾病及孕妇潜在癌症^[12]。因为母体恶性肿瘤作为NIPT假阳性的原因之一，当胎儿存在多个非整倍体时可能也预示着母体潜在癌症风险显著增加。

5 小结与展望

综上所述，国内外众多研究数据提示增加测序深度有望扩大疾病的检出范围、提高检测效能。但这是否意味未来的研究可在 NIPT-plus的基础上继续增加测序深度、优化信息算法值得继续探索。因为从卫生经济学的角度出发，尽管增加测序深度可提高准确性，但成本也随之增加。如何在临床效益与成本间找到最佳平衡点？这不仅要求技术上的创新，也需要对卫生经济学原则有深入理解，确保资源的有效配置和利用。如此，才能在提高疾病检测效能的同时，兼顾公共健康服务的可持续性和公平性。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2024–04–22）

（修回日期：2024–09–13）