基于嘌呤环检测Zn2+的荧光探针及其应用

摘 要： 基于嘌呤-色酮的席夫碱，设计、合成并论述了一种新型的检测Zn2+的开启式荧光探针（E）-3-（（2-（8，9-二（萘-1-基）-9H-嘌呤-6-基）腙）甲基）-4H-铬-4-酮（DPHC）.DPHC在DMSO/HEPES （v/v = 9：1， pH = 7.4）溶液中对Zn2+表现出显著的选择性和快速响应，并且伴随着从无色到淡绿色的颜色变化.DPHC的发射强度与Zn2+的浓度（1-5 μmol/L）之间存在良好的线性关系（R2=0.979 92），其检出限为150.0 nmol/L.Job′s plot和1H-NMR进一步证明了DPHC对Zn2+的传感机理.

关键词： 嘌呤-色酮；锌（II）; 显著选择性；快速响应；检出限

中图分类号：O657.3"" 文献标志码：A"""" 文章编号：1673-4807（2024）02-087-06

Fluorescent probe based on purine for detecting Zn2+ and its application

Abstract：A new “turn-on” fluorescent probe derived from purine-chromone Schiff base （E）-3-（（2-（8，9-di（naphthalen-1-yl）-9H-purin-6-yl） hydrazono） methyl）-4H-chromen-4-one （DPHC） for detecting Zn2+ was designed， synthesized and evaluated. The DPHC exhibited remarkable selectivity and rapid response towards Zn2+ in DMSO/HEPES （v/v=9∶1， pH=7.4）， accompanying with a significant color change from colorless to pale green. A good linear relationship （R2=0.979 92） was obtained between the emission intensity of DPHC and the concentration of Zn2+ （1-5 μmol/L） with low detection limit of 150.0 nmol/L. The sensing mechanism of DPHC to Zn2+ was supported by the Job′s plot and 1H-NMR.

Key words：purine-chromone， Zn （II）， remarkable selectivity， rapid response， low detection

离子在自然界中起着重要的作用，并且是大多数生命体生长过程中必要的需求.其中，锌离子（Zn2+）广泛存在于人体和其他生命体中[1-2].因此，锌离子是生物体生理功能的重要的微量元素之一[3].然而，过量摄入锌离子会引起神经系统紊乱以及阿尔茨海默症、免疫缺陷和癫痫等许多其他疾病[4-6].所以，锌离子的选择性识别和有效检测对化学、生物学、临床医学和农学等领域的相关研究具有重要意义[7-8].

有机小分子荧光探针以其灵敏度高、选择性强、响应时间短、效率高等优点引起众多研究组的关注[9-13].许多关于检测Zn2+的研究被报道[14-21]，但很少有基于嘌呤为母体的例子.嘌呤衍生物在自然界分布广泛，具药理活性，是一类重要的抗病毒药物[22-24].嘌呤衍生物是杂环化合物，它们是由嘧啶环和咪唑环稠合形成的化合物[25-26].它们具有平面刚性结构，含有丰富的氮原子和п-п共轭体系[27-28].因此，嘌呤衍生物可以有效地与金属离子配位，可以作为荧光探针的重要中间体[29-30].

在此，一种新型的荧光探针被设计、合成，且命名为（E）-3-（（2-（8，9-二（萘-1-基）-9H-嘌呤-6-基）腙）甲基）-4H-铬-4-酮（DPHC）.DPHC在DMSO/HEPES溶液（9/1， v/v， pH 7.4， HEPES缓冲液，0.2 mmol/L）中对Zn2+具有显著的选择性和快速响应，并且颜色可以从无色变为浅绿色.通过Job′s plot实验确定了Zn2+与DPHC的结合方式为1∶1，并通过密度泛函数（DFT）和1H NMR进一步认证了络合机制.

1 实验

1.1 试剂与仪器

所有试剂：色酮-3-甲醛、二甲基亚砜（安耐吉化学，化学纯）；乙醇（上海沃化，工业级）；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Jamp;K， 化学纯）.

所有仪器：BSA124S电子天平、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器、RE 100-pro旋转蒸发仪、79-1磁力搅拌器、UV-3010紫外分光光度计、Bruker-Advance DPX 400核磁光谱仪、Agilent-6110质谱仪、Spectrofluorometer FS5荧光光谱仪、PHS-25C pH计.

1.2 合成方法

图1为将嘌呤衍生物1a（100 mg， 0.25 mmol）与色酮-3-甲醛（65 mg， 0.37 mmol）溶解在乙醇（2 mL）中，然后将混合物回流反应2 h，待反应完全.冷却至室温，抽滤，用乙醇洗涤固体，得到淡黄色固体（72 mg， 52 %）.

DPHC的表征：1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ12.19 （s， 1H）， 8.84 （s， 1H）， 8.59 （s， 1H）， 8.35 （s， 2H）， 8.15 （dd， J=7.9， 1.7 Hz， 1H）， 7.98 （t， J=7.4 Hz， 2H）， 7.93-7.82 （m， 3H）， 7.74-7.65 （m， 2H）， 7.58-7.47 （m， 6H）， 7.41 （dd， J=4.7， 1.7 Hz， 2H）， 7.32 （dd， J=8.3， 7.2 Hz， 1H）. 13C NMR （101 MHz， DMSO-d6） δ175.44， 156.23， 154.15， 153.32， 150.88， 134.98， 134.00， 133.39， 131.84，131.50，130.61，130.26，130.10，129.34，128.67 （d，J=6.6 Hz），127.87 （d，J=12.1 Hz），127.43，127.22 （d，J=12.6 Hz），126.86，126.36 （d，J=14.7 Hz），125.74 （d，J=12.2 Hz），125.01，123.85，122.91，119.54，119.16，118.79. ESI-MS： calcd. for" + 559.2，found 559.2.

2 结果与讨论

2.1 DPHC对金属离子的光学作用

为了研究探针DPHC的金属离子响应，首先，在DMSO/HEPES的缓冲溶液中，将探针与不同金属阳离子（Zn2+， Co2+， Ni2+， Al3+， Cr3+， Mn2+， Mg2+， Ba2+， Pb2+， K+， Ca2+， Cs2+， Na+， Ag+， Cd2+， Pd2+， Fe3+ 和 Cu2+）络合并进行荧光测试.如图2，在添加Zn2+后，探针会在509 nm处有强发射，而其他离子并没有引起发射增强.另外，通过荧光灯照射可以发现，探针标样本身无色，但加入锌离子后，溶液从无色变为浅绿色.

接着，为了进一步探索DPHC对Zn2+的选择性，在相同体系中进行了竞争实验.DPHC首先与Zn2+（5 eq）进行络合，然后分别添加相同当量的其他离子（Co2+， Ni2+， Al3+， Cr3+， Mn2+， Mg2+， Ba2+， Pb2+， K+， Ca2+， Cs2+， Na+， Ag+， Cd2+， Pd2+， Fe3+ 和 Cu2+）（5 eq）.如图3，在多离子存在情况下，Cu2+具有一定的淬灭作用，而DPHC-Zn2+的荧光强度受其他离子干扰较少.

2.2 DPHC的络合机制

为了探究DPHC与Zn2+的灵敏度，进行了滴定实验（图4）.通过实验结果可以发现，在509 nm处DPHC的荧光强度随着Zn2+的浓度增加而增加，并且在离子达到5个当量时候饱和.如图5，探针DPHC在509 nm处的荧光强度与Zn2+之间表现出良好的线性关系（R2=0.979 92）.通过3Sb1/S公式计算，可以得出DPHC-Zn2+的检出限为150 nmol/L，这远远低于WHO规定的允许值（76.0 μmol/L）.另外，通过Benesi-Hildebrand（图6）方程确定了DPHC与Zn2+的络合常数K为7.616×10-5.

接着，为了研究探针DPHC与Zn2+的络合机制，绘制了Job′s plot图，从图7中可以发现，在Zn2+的摩尔分数达到0.5时，观察到最大发射波长，这表明DPHC与Zn2+之间的络合比为1∶1.因此，可以得出结论：DPHC通过4个位点与Zn2+络合，其可能的结合模式如图8.

为了进一步验证DPHC的络合方式，使用Gaussian 09 W进行密度泛函理论计算（DFT）.如图9，Zn2+与探针DPHC的亚胺氮原子和羰基配位，形成类四面体的结构.在DPHC-Zn2+的络合物中，Zn-O键长为2.064 93 ，Zn-N键长为2.053 52（Zn - N嘌呤-氮）.

结果表明，DPHC可以提供足够的空间来容纳Zn2+.此外，DPHC和DPHC-Zn2+的HOMO-LUMO的差值为0.140 47 a.u.和0.132 59 a.u..因此，DPHC-Zn2+的差值低于DPHC的差值，这可以通过DPHC-Zn2+络合物在探针DPHC吸收光谱红移来解释.此外，图10介绍了DPHC-Zn2+络合物的核磁谱图，在加入Zn2+（1 eq）到DPHC后，亚胺环的质子从7.47×10-6到8.35×10-6，这也支持了以下观点：亚胺参与了与Zn2+的络合.

2.3 探针的实际应用

对于探针的实际应用，络合时间长短与稳定性至关重要.如图11，DPHC和Zn2+络合后的荧光强度，在短短10 s内就能达到最高值.此外，在60 s的持续时间内，探针DPHC与Zn2+络合后的产物的荧光强度保持不变，这表明DPHC对Zn2+的检测足够稳定.

此外，为了探究探针DPHC在不同pH下对Zn2+的检测效果.首先，使用1 mol/L的HCl或NaOH将储备液的pH值制备成2.0～13.0.如图12，探针DPHC的荧光强度在6～9的pH范围内没有明显变化.当添加Zn2+后，在509 nm处，探针DPHC在2.0～13.0的pH范围内显著增强，并且在pH=7时候荧光强度最高.然而，在强酸条件下（pHlt;6），未观察到明显的荧光信号，这有可能是探针结构中多个氮原子发生了质子化，不利于探针与Zn2+的配位.此外，在碱性条件下（pHgt;9）的发射强度逐渐降低，这有可能是因为Zn2+与OH-结合形成Zn（OH）2，从而降低了Zn2+的浓度.综上可以得出结论，DPHC检测Zn2+的最佳pH值为6.0～9.0.

通过试纸实验来进一步证明DPHC的实用性（图13）.首先，制备滤纸条并用DPHC溶液（1 mmol/L）浸泡，然后再空气中干燥.将制备好的试纸浸泡到不同浓度的Zn2+溶液中（0、0.3、1.0 mmol/L），通过荧光等观察到试纸由深色变为浅色.因此，探针DPHC可以以固体形式测试Zn2+.

3 结论

（1） 一种新型的基于嘌呤衍生物与色酮-3-甲醛的席夫碱结构的荧光传感器DPHC被设计合成，该探针是基于PET机制设计的，分子内诱导转移限制了探针本身的荧光强度，当加入Zn2+后，PET过程受到抑制，荧光强度增强并伴随着显著的颜色变化.

（2） 探针在DMSO/HEPES溶液体系中对Zn2+具有高选择性和高灵敏度：探针DPHC可以在10 min内对Zn2+进行“开启”式荧光效应；该探针的pH适用范围是6.0～9.0.

（3） DPHC对Zn2+的检出限低至150.0 nmol/L，这远远低于WHO规范的标准.此外，Job′s plot确定了Zn2+与DPHC结合的化学计量为1∶1，并且密度反函数（DFT）和1H NMR进一步证明了其结合机制.探针的试纸实验证明了该探针的实用性.

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