家畜血液储存条件及预处理方式对种属鉴定的影响

摘 要 目的：考察血液储存时间、储存温度和预处理方式对种属鉴定的影响。方法：以猪、牛、羊血液为样本，考察储存时间、储存温度和预处理方式对种属鉴定的影响。储存时间考察1周和3周，储存温度考察4 ℃和？20 ℃，预处理方式考察是否去除红细胞。样本经DNA提取，PCR-RFLP检测后进行结果判定。结果与结论：储存1周时，两种储存温度及预处理方式均能正常进行种属鉴定。储存3周时，两种储存温度，预处理时不去除红细胞会产生假阴性判定，假阴性是由于提取的DNA中存在PCR抑制物；预处理时去除红细胞可正常检测。该结论对于猪、牛、羊血液具有普适性。

关键词 血液 种属鉴定 PCR抑制物

中图分类号：TQ464.8； TQ460.4 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2024）15-0087-04

引用本文 王欣， 董蕾， 汪雅雯. 家畜血液储存条件及预处理方式对种属鉴定的影响[J]. 上海医药， 2024， 45（15）： 87-90.

The influence of blood storage conditions and pretreatment methods on species identification in livestock

WANG Xin， DONG Lei， WANG Yawen

（SPH NO.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the effects of different storage time， temperature and pretreatment methods on the results of blood species identification. Methods： The effects of storage time（one or three weeks） and temperature （4 or ？20 ℃） and pretreatment methods （removing red blood cells or not） on species identification were investigated taking the blood of pig， bovine and sheep for samples. The samples were subjected to DNA extraction and PCR-RFLP detection for result determination. Results & Conclusion： The samples could be used for normal species identification when stored for one week and at 4 or ？20 ℃ and pretreated by removing red blood cells or not. The false-negative verdicts were generated when samples were stored for 3 weeks at either 4 or ？20 ℃ and the red blood cells were not removed during pretreatment， which may be due to the presence of PCR inhibitors in the extracted DNA. The species identification could be normally performed by removing red blood cells during pretreatment. This conclusion has general applicability to pig， bovine and sheep blood.

KEY WORDS blood； species identification； PCR inhibitors

凝血酶散来源于猪或牛血液，是一种国际公认的速效局部止血药，已列入国家基本药物，属于国家医保甲类药品。近年来，随着GMP生化药品附录、中国药典、CDE对生化药品在种属控制方面要求的提高，需建立一种适合血液样本的种属鉴定方法。2020年版中国药典四部通则“1001聚合酶链式反应法”[1]中明确了一种基于限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）对猪、牛、羊源性成分进行种属鉴定的方法，将该方法用于血液样本时，检测结果不稳定，存在较大波动，甚至出现假阴性结果。本研究考察了3种影响血液种属鉴定的因素，包括样本储存温度（4 ℃和-20 ℃）、储存时间（1周和3周）及预处理方式（是否去除红细胞）。通过三因素两水平的系统考察，明确样本储存和预处理方式，保证后续检测高效、结果稳定。

1 材料和方法

1.1 材料

猪、牛、羊血液（含4%柠檬酸钠）源自我公司；猪、牛、羊源性胰脏基因组DNA（10 ng/mL）购自Zyagen公司；Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒、琼脂糖、6×甘油凝胶上样缓冲液Ⅶ、DNA分子量标准A（均购自上海生工生物；2×Premix Taq（EX Taq version 2.0）、限制性内切酶Sau3AⅠ购自Takara公司；无DNA酶/RNA酶去离子水购自天根生化公司；GelRed核酸染料购自Biotium公司；限制性内切酶MnlⅠ、DpnⅡ购自New England Biolabs；无水乙醇购自上海振兴化工一厂；引物由上海生工生物合成。

1.2 仪器

ETC821D PCR仪（苏州东胜龙公司）；5418R离心机（Eppendorf公司）；LP涡旋震荡器、Multiskan sky微量核酸定量仪（Thermo Scientific公司）；HHD-2恒温水浴锅（上海比朗仪器）；XSR204/AC电子天平（梅特勒公司）；Powerpac Basic电泳仪、GelDoc凝胶成像仪（Bio-Rad公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 血液处理

猪、牛、羊血液中均含有4%柠檬酸钠，将新鲜血液分装200 mL/管，置于4 ℃和-20 ℃，放置1周和3周后进行检测。

1.3.2 血液中DNA的提取

取1管分装样本，利用Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。样本预处理方式分两组，一组使用红细胞裂解液去除红细胞，另一组不去除红细胞，获得的DNA溶液使用微量核酸定量仪检测浓度和纯度，进行后续PCR-RFLP检测。

1.3.3 PCR-RFLP检测

采用2020年版中国药典四部通则“1001聚合酶链式反应法”中所列猪牛羊源鉴定引物进行PCR扩增和限制性内切酶酶切[1]。PCR反应体系：2×Premix Taq 12.5 mL，DNA模板1 mL，上游引物（10 mmol/L）1 mL，下游引物（10 mmol/L）1 mL，加去离子水至25 mL。PCR反应条件：94 ℃变性3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72℃ 50 s，30个循环后，72 ℃ 10 min；反应结束后于8 ℃保温。限制性内切酶酶切体系：PCR反应产物8.5 mL，限制性内切酶0.5 mL，酶切缓冲液1 mL。酶切反应条件：37 ℃ 60 min，65 ℃ 20 min。反应结束后于8 ℃保温。猪源性成分扩增条带为212 bp，酶切后两条带为196和16 bp；牛源性成分扩增条带为271 bp，酶切后两条带为214和57 bp；羊源性成分扩增条带为293 bp，酶切后两条带为202和91 bp。

1.3.4 电泳检测及凝胶成像

配制3%（w/v）琼脂糖凝胶，取10 mL PCR扩增产物加入2 mL 6×甘油凝胶上样缓冲液Ⅶ混合后上样，140 V恒压电泳40 min，凝胶成像仪成像。通过与DNA分子量标准对比，比较样品PCR产物及酶切产物与阳性对照条带的一致性，从而对样品是否含有猪牛羊源性成分进行判定。

2 结果

2.1 PCR-RFLP法适用于血液的种属鉴定

以新鲜猪、牛、羊血液（含4%柠檬酸钠）为样本，按照1.3.2所述的两种预处理方式提取DNA，A260/A280均大于1.8，浓度均大于20 ng/mL，表明获得的DNA纯度好、浓度高，适用于后续PCR扩增。随后按照1.3.3进行PCR-RFLP检测，均检测出与相应阳性对照相一致的条带（图1），表明药典通则所述PCR-RFLP法适用于血液的种属鉴定。

2.2 血液放置时间影响种属鉴定的结果判定

放置于4 ℃和-20 ℃的猪、牛、羊分装血液，于第1周和第3周时取出，均按照表1进行8组实验。提取所得DNA的A260/A280均大于1.8，浓度均大于20 ng/mL。第3周取出、于4 ℃及-20 ℃储存时，不去除红细胞的样品无法检出扩增条带，而去除红细胞的样品可扩增出清晰条带。

2.3 无扩增条带是由于DNA中存在PCR抑制物

结果显示，理应扩增出条带的样品未见条带，且在该样品中加入阳性对照仍无扩增条带，从而显示“阴性”，而阳性对照可扩增条带（图2）。我们推测，“阴性”条带是由于抽提DNA样品中存在某些PCR抑制物而导致的假阴性结果。

3 讨论

常见PCR抑制物包括体液中各种成分和实验所用试剂（如血红蛋白、尿素、肝素）、食物成分（如有机和酚类化合物、糖原、脂肪和Ca2+）、环境化合物（如酚类化合物、腐植酸和重金属）[2]。有研究报道血液是一种常见的PCR抑制剂，当PCR反应体系中血液的体积比超过4%时会产生抑制作用，研究人员推荐每100 mL反应体系中血液比例低于1%～2%，方可保证血液中的序列正常扩增[3]。血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞中的主要PCR抑制物[4-5]，血红蛋白和乳铁蛋白中都含有铁离子，由于铁离子会干扰DNA合成，抑制机制可能与这些蛋白在PCR混合物中释放出铁离子有关。此外，血红蛋白的衍生物，包括胆红素、胆盐和血红素，均具有PCR抑制作用。血红素通过反馈抑制作用调节DNA聚合酶活性，协调红细胞中血红蛋白成分的合成，与目标DNA竞争结合DNA聚合酶[6]。

因此，血液作为一种含有PCR抑制物的特殊样本，在进行种属鉴定时，结果判定受样本储存条件及预处理方式的影响较大。本研究考察了血液储存温度（4 ℃和-20 ℃）、储存时间（1周和3周）及预处理方式（是否去除红细胞）对检测结果的影响，结果显示储存1周时，两种储存温度及预处理方式，均能正常检测到各自的扩增条带；储存3周时，两种储存温度，预处理时不去除红细胞会产生假阴性判定，假阴性是由于提取的DNA中存在PCR抑制物；预处理时去除红细胞可正常检测到扩增条带。该结论对于猪、牛、羊血液具有普遍适应性。因此，本研究完善了血液样本的储存和预处理方法，对提高血液样本中动物源性成分种属检测效率具有一定的指导意义。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2020年版四部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 153-155.

[2] Wilson IG. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification[J]. Appl Environ Microbiol， 1997， 63（10）： 3741- 3751.

[3] Mercier B， Gaucher C， Feugeas O， et al. Direct PCR from whole blood， without DNA extraction[J]. Nucleic Acids Res， 1990， 18（19）： 5908.

[4] Al-Soud WA， R？dstr？m P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39（2）： 485-493.

[5] R？dstr？m P， Knutsson R， Wolffs P， et al. Pre-PCR processing： strategies to generate PCR-compatible samples[J]. Mol Biotechnol， 2004， 26（2）： 133-146.

[6] Byrnes JJ， Downey KM， Esserman L， et al. Mechanism of hemin inhibition of erythroid cytoplasmic DNA polymerase[J]. Biochemistry， 1975， 14（4）： 796-799.