基于UPLC-Q-TOF/MS技术的成人草酸钙尿石症血液代谢组学研究

摘要：目的" 基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术，通过血液代谢组学寻找成人草酸钙尿石症潜在的生物标志物和代谢机制，以指导草酸钙结石的临床诊治。方法" 前瞻性收集2017年10月—2018年7月北京友谊医院收治的36例双侧上尿路草酸钙结石患者的血液样本并与36例健康体检者的血液样本对照。采用UPLC-Q-TOF/MS技术进行代谢指纹图谱分析。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对多元数据进行分析。通过对比人类代谢组数据库确定潜在的生物学标记物。最后对所鉴定的化合物行代谢通路分析并构建代谢网络图。结果" PCA和OPLS-DA结果显示健康对照者与结石患者血液代谢物存在显著差异。进一步鉴定出包括亚油酸、枸橼酸、尿酸等29种与草酸钙结石患者血液相关的代谢物，以及胆汁酸合成通路、脂肪酸生物合成通路、甘油磷脂代谢通路、鞘脂代谢通路和嘌呤代谢通路等9条血液代谢通路。结论" 基于UPLC-Q-TOF/MS平台进行血液代谢组学分析，找到了29种成人草酸钙尿石症的潜在血液生物标志物，而嘌呤代谢与脂质代谢可能与草酸钙结石的成因相关。

关键词：生物学标记物；代谢组学；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱；草酸钙；尿石症；血液代谢

中图分类号：R691.4""" 文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.09.015

Blood metabolomics research for calcium oxalate urolithiasis in adults based on UPLC-Q-TOF/MS

WANG Xiangyu，JI Jiayuan，CUI Teng，XIAO Jing

（Department of Urology，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China）

ABSTRACT：Objective" Based on ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/MS），the potential biomarkers and metabolic mechanisms of adult calcium oxalate urolithiasis were identified to guide the diagnosis and treatment of calcium oxalate lithiasis.Methods" Blood samples of 36 patients diagnosed with bilateral upper urinary tract calcium oxalate stones and 36 healthy controls admitted to our hospital during Oct.2017 and Jul.2018 were collected.Metabolic fingerprints were analyzed with UPLC-Q-TOF/MS.The multivariate data were analyzed with principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）.Potential biological markers were identified by comparing human metabolome datasets.Finally，the metabolic pathways of the identified compounds were analyzed and the metabolic network map was constructed.Results" PCA and OPLS-DA showed significant differences in blood metabolites between patients and healthy controls，and identified 29 blood-related metabolites，including linoleic acid，citric acid，uric acid and so on.The most relevant blood metabolic pathways were bile acid synthesis pathway，fatty acid biosynthesis pathway，glycerophospholipid metabolism pathway，sphingolipid metabolism pathway and purine metabolism pathway.Conclusion" Blood metabolomics analysis based on the UPLC-Q-TOF/MS platform identified 29 potential blood biomarkers of adult calcium oxalate urolithiasis，and purine and lipid metabolism may be related to the genesis of calcium oxalate stones.

KEY WORDS：biomarker; metabolomicsHYPERLINK\"javascript：ViewClassDetails（131）\";" ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/MS）; calcium oxalate; urolithiasis; blood metabolomics

收稿日期：2023-12-24""" 修回日期：2024-03-26

通信作者：

肖荆，主任医师。E-mail：drxiao830@163.com

作者简介：

王翔宇，博士研究生，住院医师。研究方向：泌尿系结石。E-mail：18769513071@163.com

泌尿系结石具有较高的患病率和复发率，男性患病率约10.6%，女性约7.1% ［1］；术后2、5、10、15年的复发率分别为11%、20%、31%、39% ［2］。而其中74%的肾结石含有草酸钙（calcium oxalate，CaOx）成分［3］。然而，目前关于结石的病理生理机制尚不清楚，因此寻找结石相关生物学标记物及相应的代谢通路至关重要。

代谢组学是一种用来检测生物样本所有小分子化合物的方法［4］，为寻找特定疾病引起的内源性代谢物的差异提供了有效途径，而差异内源代谢物可能作为疾病诊断、预后和治疗反应的潜在生物标志物［5］。同时，代谢组学有助于揭示特定疾病的潜在机制。本课题组已进行了有关人类CaOx结石尿液代谢组学的首项研究，并发表了相关成果，但尿液受饮食及泌尿系感染等影响较大，其代谢物波动较大，无法精准反映人体内代谢状态，因此本课题组尝试收集患者血液进行代谢组学分析。本研究基于超高效液相色谱联合四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）的代谢组学方法对比分析成人双侧上尿路CaOx结石患者血液样本，旨在鉴定成人CaOx上尿路结石的生物学标记物，找到相应的代谢通路，为泌尿系结石的诊断、预防提供理论依据。

1" 材料与方法

1.1" 患者筛选和样本收集

前瞻性收集2017年10月—2018年7月北京友谊医院泌尿外科住院治疗的36例泌尿系结石患者临床资料和生物学样本。入组标准：①经腹部、盆部计算机断层扫描（computed tomography，CT）确诊的双侧上尿路结石患者；②年龄18～50岁；③患者行输尿管镜碎石或经皮肾镜碎石取到结石标本，经红外光谱结石成分分析证实为一水CaOx、二水CaOx或两者的混合物。排除标准：①含有明确的尿路解剖畸形引起梗阻；②含有尿路异物等结石高危因素。在北京友谊医院体检中心匹配与每例结石患者年龄、性别相同的体检者作为对照组。本研究获得北京友谊医院伦理委员会批准（2018-P2-231-01），所有参与者均已签署知情同意书。

1.2" 样本的采集及前处理

于入院第2天采集患者清晨空腹血液样本，采用血浆抗凝剂乙二胺四乙酸二钾抗凝，最终取得患者血液样本36份。同法收集健康体检者的空腹血液检测样本。所有结石组患者及健康对照均来自北京及其周边地区，且样本采集前1 d所有患者及健康对照者均清淡饮食，尽量减少环境、饮食习惯的影响。

采集的全血样本，在4 ℃条件下以3000 r/min的速度离心10 min，随后取上清液分装至1.5 mL的试管内，于－80 ℃的冰箱中保存。上样前，将样本取出放置在25 ℃的温度下解冻。在200 μL的血浆样本中加入600 μL的1∶4甲醇水沉淀蛋白，震荡混匀后，以3000 r/min的速度离心10 min，取400 μL的上清液使用氮气吹干仪吹干后，加入150 μL的甲醇，并经过超声震荡和3000 r/min的速度离心处理10 min。最后，取上清液加入内衬管中。质控样本（quality control，QC）从所有样本中分别取出5 μL混合而成。每采集7针样本后采集1次QC数据，以检测仪器稳定性。

1.3" 数据采集

数据采集应用Waters ACQUITY UPLC系统（Waters公司，Milford，MA，USA）。采用MassLynx V4.1进行参数设定和总离子流图（total ion chromatogram，TIC）的简单判定。

色谱分离法采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司，美国）。流动相A是指质量分数为0.1%的甲酸，B为乙腈。UPLC的洗脱条件为：0～0.5 min，0～2% B；0.5～7.0 min，2%～20% B；7.0～9.0 min，20%～35% B；9.0～15.0 min，35%～80% B；15.0～17.0 min，80%～98%B；17.0～26.0 min，98% B；26.0～26.5 min，98%～2% B；26.5～30.0 min，2% B。流量设定为0.35 mL/min，进样量为4 μL。采集温度设定为35 ℃。

质谱分析采用Q-TOF/MS（Synspt G2-Si，Waters公司，美国），分析过程采取正离子模式（ESI＋模式）和负离子模式（ESI－模式）。参数设定为：毛细管电压1 kV，脱溶气体流量800 L/h，反溶剂温度450 ℃，源温度120 ℃，锥形气流50 L/h，喷雾气压6 bar（1 bar=100 kPa），取样锥电压20 V。采集模式为全信息串联质谱的分辨率模式。在全扫描模式下，质量范围设置为50～1050 m/z（质荷比）。ESI＋模式选取LE（亮氨酸脑啡肽）556.277 1作为调谐和校正的参比物质，ESI－模式选取LE（亮氨酸脑啡肽）554.261 5作为调谐和校正的参比物质进行采集。

1.4" 数据处理" 上述原始数据采集后导入Progenesis QI v2.0软件进行数据对齐、峰提取、归一化和去卷积等。归一化的方式为总峰面积归一化。采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）评估代谢物在平均值中的统计学意义，P＜0.05为差异有统计学意义。将多元数据导入EZinfo 3.0软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares determinant analysis，OPLS-DA），OPLS-DA中R2Y表示所建模型对Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，理论上R2、Q2数值越接近1说明模型越好，越低说明模型的拟合准确性越差。利用OPLS-DA生成投影中的重要度变量（variable importance in projection，VIP），展示变量对向量形成的影响。患者基线资料对比及受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线构建通过SPSS 19.0软件进行。

1.5" 生物学标志物鉴定

将根据VIP值区分的标志物数据导回Progenesis QI，并对比人类代谢组数据库（human metabolome databaseHYPERLINK\"https：//www.baidu.com/link？url=e7RZQ4Eiuy84KZRgcwMrkE0GSuXJziJu0BDAwl9jF_qamp;wd=amp;eqid=81ad6e650002ad73000000035e645896\"＼t\"_blank\"，HMDB）分子量、质荷比等参数，根据方差分析结果和来自OPLS-DA的VIP值，筛选潜在的用于区分结石组患者和健康对照组的生物标志物。筛选条件为：VIP＞1，ANOVA Plt;0.05，有二级碎片信息且数据库中可以鉴定，Progenesis QI软件鉴别分数＞35。符合条件的化合物被采纳鉴定为潜在的生物标记物。

采用SPSS 19.0软件进行ROC曲线分析，通过灵敏度、特异度及曲线下面积（area under the curve，AUC）衡量这些生物学标志物的诊断效能。将鉴定的标志物通过https：//www.metaboanalyst.caHYPERLINK\"https：//www.metaboanalyst.ca\"网站导入京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and GenomesHYPERLINK\"https：//www.baidu.com/link？url=q1nsv4Cx7DYb5yOFYaa4wJPPZpHsGbm_rDdbmlbdkvOamp;wd=amp;eqid=bf55301900654e82000000035e48a5f6\"＼t\"_blank\"，KEGG）及小分子通路数据库（Small Molecular Pathway Database，SMPDB）行代谢通路分析，找出涉及的代谢通路并绘制代谢网络图。

2" 结" 果

2.1" 两组样本来源人群的基线资料比较

结石组患者的平均年龄为（44.0±8.8）岁，其中男性22例，女性14例。结石组尿白细胞阳性患者数较对照组多，差异有统计学意义（P＜0.001），其余资料两组比较差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

2.2" PCA结果

通过PCA得分图可以看出，两组样本之间代谢物成分存在差异，而组内样本具有相对共同的信息特征。QC样品在PCA得分图中均有聚集的趋势，说明实验过程系统状态良好（图1）。通过EZ-info软件可以看出，在ESI+模式下有5320个变量，而ESI－模式下有5109个变量。

2.3" OPLS-DA结果

ESI＋及ESI－模式血液多参数数据的OPLS-DA得分图显示两组之间代谢物成分有显著差别（图2）。本研究中，ESI＋模式R2Y=97%、Q2=96%，ESI－模式R2Y=98%、Q2=97%，具有比较高的准确性和预测能力。

2.4" CaOx 结石患者潜在血液生物学标记物鉴定

鉴定出的血液潜在生物学标记物信息，以及ROC曲线计算的AUC、代谢物化学式和涉及的代谢通路见表2。表中化合物均按质荷比大小从低到高排序。共有29种代谢物被挑选鉴定，涉及9条代谢通路。

我们利用化合物归一化丰度绘制了ROC曲线来研究这些生物学标志物的诊断能力，用AUC来评估诊断效能。29个标志物的AUC范围为0.604～0.822（表2），其中11个标志物具有较高的特异度和灵敏度（AUCgt;0.7）。图3显示了5种AUC较高的血液代谢物的ROC曲线。

2.5" 代谢通路分析

通过MetaboAnalyst网站的通路分析进行血液代谢途径的分析（图4），代谢通路分析通过比对KEGG和SMPDB数据库。相关性最大的代谢途径是胆汁酸合成、脂肪酸生物合成、嘌呤代谢、鞘脂代谢和甘油磷脂代谢。

3" 讨" 论

代谢组学在尿石症中的应用很少［6］，近期一篇综述总结其在泌尿系结石中的应用，指出代谢组学已经提供了几种可能防止或促进结石形成的潜在代谢物［7］，同样代谢组学可联合微生物组学来探究结石成因［8］。既往有研究应用代谢组学的方法寻找小鼠CaOx肾结石潜在的生物学标记物并阐述了一些药物治疗小鼠肾结石的作用机理，如连钱草 （Glechomae Herba）［9］、复方金钱草颗粒（Fu-Fang-Jin-Qian-Chao herbal granules）［10］和血尿安（Xue Niao An）［11］等药物。CHAO等［12］运用同样的方法行小鼠脂质代谢组学发现脂质代谢与CaOx结石形成密切相关。这些有关动物CaOx结石的代谢组学研究，已经从尿液或血清样本中发现了异常的代谢物谱。最近一项运用代谢组学进行动物实验的研究表明，琥珀酸盐作为三羧酸循环的关键参与物，可以减少动物模型肾脏中钙的沉积和损伤［13］。然而，这些CaOx肾结石是通过给动物注射或喂食相应的化学药物继发引起的，这极有可能与人类CaOx尿石症形成的机制不同。目前代谢组学应用于人类的文献报道非常少，且有一定的局限性。部分研究比较浅显，并无定性及定量结果［14］；部分研究针对极为特殊和有明确病因的结石（如三聚氰胺暴露）［15］或针对特殊人群（如儿童［16］）。同样有研究纳入了不同种类的结石，包括CaOx结石、尿酸石、碳酸磷灰石等成分，而不同成分的肾结石代谢成因可能并不相同［17］。

既往多项研究表明尿石症是一种与代谢综合征、慢性肾脏疾病、高血压、糖尿病和冠状动脉疾病相关的全身性疾病［18］。双侧上尿路结石可以排除单侧潜在的解剖畸形等偏倚因素影响，其结石病因更可能与全身性疾病或代谢紊乱相关。因此，本研究选择分析双侧上尿路结石患者的生物学样本，以鉴定CaOx结石潜在的生物标志物，并通过代谢通路分析，尽可能探究CaOx成因及发病机制。本课题组首次应用基于UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学方法研究成人CaOx结石尿液成分［19］。虽然尿液中的化学成分对泌尿系结石形成可能有直接的关系，但是不能确定这些代谢物与CaOx结石的因果关系。所以本团队用类似的方法对相应的患者进行了血液代谢组学研究，本项研究也是首次将基于UPLC-Q-TOF/MS技术的血液代谢组学分析应用于成人CaOx尿石症的研究。PCA、OPLS-DA结果显示了健康对照者与CaOx尿石症患者血液相比存在代谢物表达差异。我们还鉴定了29种与CaOx尿石症相关的血液代谢物，涉及9种代谢途径。

本研究中尿石症患者血液中的枸橼酸降低，而枸橼酸盐已被证明是含钙结石形成的抑制因子。它可以通过多方面的机制抑制CaOx晶体的生长［20］。脂质在泌尿系结石形成中起重要作用。研究表明，尿石症患者尿液中胆固醇、胆固醇酯和甘油三酯的水平明显高于健康人群［21］。现有的动物模型证据表明，高脂肪饮食可导致尿液pH值降低，易于形成尿酸晶体和含钙晶体。此外，有证据表明，食用高脂肪食物的动物，尿液中草酸盐和钙的含量增加，晶体滞留在尿路上皮从而造成肾损伤［22］。本研究血液样本中结石组患者与健康成人之间存在多种脂质代谢成分的区别，高度提示脂质代谢异常与结石形成相关。本研究发现，相比健康对照组，结石组血液中的DHA、亚油酸和α-亚麻酸、油酸、棕榈酸及硬脂酸含量均较低，结合既往文献报道，我们认为部分脂肪酸对CaOx结石的产生有保护作用，尤其是n-3多聚不饱和脂肪酸及其代谢产物，可能是与这些脂肪酸参与减少氧化应激及炎症反应相关，小鼠CaOx模型脂质组学也显示了类似的结果［6］。结石组患者血液中神经鞘磷脂、一磷酸鞘氨醇含量减低，整体鞘脂代谢产物都是降低的状态，我们推测鞘脂代谢可能对肾CaOx结石的形成有保护作用，其机制可能也与抑制炎症反应相关。

初级胆酸、胆酸和鹅去氧胆酸由胆固醇在肝脏内合成，与甘氨酸和牛磺酸结合后暂时储存和集中在胆囊内，协助消化吸收脂质，并可以促进胆固醇的排泄［23］。未被吸收的胆汁酸和脂肪酸通过诱导钙皂化作用，破坏自由钙和草酸在肠道内的结合，增加肠道对草酸盐的吸收，从而增加CaOx尿石症的发生风险［24］。本研究结果显示，相较于健康对照组，结石组患者血液中胆酸、牛黄脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨胆酸及牛黄胆酸明显升高，可能提示胆酸合成通路代谢物会提高结石发病率。

本研究涉及的血液中代谢物肌酐、次黄嘌呤、尿酸和XPPPPX均参与嘌呤代谢。本研究中，尿石症患者血液中尿酸、肌酐和次黄嘌呤升高，而XPPPPX降低。根据嘌呤代谢途径，不论是肌酐、次黄嘌呤的升高，还是XPPPPX的降低都可能导致尿酸的升高，而尿酸可以促进CaOx晶体成核［25］。

本研究仍存在一些局限性：①患者饮食习惯及外源性物质对代谢组学的结果有影响。本研究结果发现，亚油酸和α-亚麻酸及其代谢产物很可能由饮食摄取而来，但我们对患者具体的饮食情况并未做研究。②各种慢性疾病及代谢性疾病都会影响代谢物组学的结果，甚至带来偏倚，需要对其机制进行更深入的研究，以说明结果的意义。③由于所有样本是在碎石术前采集，继发的泌尿系感染或结石可能会引起组织损伤，从而造成代谢物的差异，更多样本的对比以及采集患者术后完全恢复的样本可避免此偏倚。④结石成分分析为一水CaOx、二水CaOx或二者混合，后续还需开展进一步研究一水CaOx/二水CaOx比例阐述结石成因。与所涉及的具体代谢物和代谢通路对CaOx结石成因影响的机制还需要进一步深入研究。

综上所述，本研究利用UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学方法对比分析成人双侧上尿路CaOx结石患者血液样本，发现CaOx结石患者血液代谢物成分与健康对照者存在显著差异，鉴定了29种与CaOx尿石症相关的血液标志物，嘌呤代谢与脂质代谢可能与CaOx结石成因相关。

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（编辑" 郭楚君）