神经退行性疾病早期标志物检测的研究进展

[摘要]神经退行性疾病是一组由神经元变性或髓鞘缺失而引起的慢性疾病。常见的神经退行性疾病主要包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等。神经退行性疾病的发病率与年龄相关，致残率和致死率高，对中老年患者来说是极其致命的。神经退行性疾病不仅使患者饱受病痛折磨，还会无形中增加家庭和社会负担。目前，神经退行性疾病常通过患者的临床表现予以确诊，但确诊时患者已发生不可逆性损伤，延误疾病的治疗。若在疾病发生轻微病理变化之前早期快速、准确地发现疾病隐患，不仅可延缓疾病进程，还能减轻患者的痛苦和经济负担。基于此，本文对神经退行性疾病早期标志物检测的研究进展进行综述，分析各检测方法的优缺点，为该类疾病的诊断和治疗提供借鉴和帮助。

[关键词]神经退行性疾病；阿尔茨海默病；帕金森病；检测方法；早期标志物

[中图分类号]R319[文献标识码]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.032

神经退行性疾病是一种与中老年人群有关的神经系统退行性疾病，主要包括阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）、帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）和亨廷顿病（Huntingtondisease，HD）等。其中，HD是一种罕见的常染色体显性遗传病，主要由亨廷顿基因上的CAG三核苷酸重复表达，导致异常蛋白质生成并堆积在脑内，影响神经细胞的功能，进而导致一系列临床症状的发生。临床上可根据家族性谱系分析和基因检测技术早期确诊HD。在孕妇产前检查时，应用上述方法也可极大降低HD患儿的出生率，降低HD的患病率。HD的早期检测方法特异性高、方法单一，在临床上较为成熟。相比于HD，AD和PD的检测方法则更为多样。临床上尚无治疗AD和PD的特效药，根治成为临床治疗的难题之一。为缓解疾病进展，早期检测成为AD和PD治疗的一项重大举措。现阶段，AD和PD的确诊常通过患者的临床表现进行判断；这易使患者错过最佳的治疗时间。部分检测方法价格昂贵，具有侵袭性，对家属和患者来说也是一个难题。因此，亟待寻找一种检测方法，可通过疾病的早期标志物检测发现、延缓或预防疾病。本文主要分析和总结AD和PD的早期标志物检测方法，并对这些方法进行比较和评估，以期为AD和PD的早期发现及干预治疗提供帮助和参考。

1AD早期标志物的检测

AD是一种起病隐匿的中枢神经系统退行性疾病。β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积及由微管相关蛋白Tau形成的神经元纤维缠结是AD的典型病理特征。AD的发生已影响到全球5000万例患者，预计到2050年AD患者将达150万例[1]。因此亟需医疗领域发现一种有效方法以扼制患病人数的增加，且防重于治，目前AD的早期检测成为迫切需求。临床上AD的检测主要有以下方法：医生根据患者的临床症状进行评估，这要求医生具有丰富的临床经验；利用磁共振成像技术检测大脑内部结构和功能的变化，虽然该方法具有无创性，图像直观，但这种技术不能在早期诊断；利用正电子发射断层成像（positronemissiontomography，PET）检测活体病灶，该方法可从分子和细胞水平进行早期检测，但价格昂贵，不利于大多数患者接受；通过脑脊液分析患者大脑内的Aβ、Tau蛋白等，该方法诊断AD的敏感度及特异性较高，但脑脊液标本不易取材。上述方法均存在一定的缺陷，寻找一种敏感度高、操作简单、安全性高、费用低的检测方法尤为重要。目前，研究报道的几种新型的AD早期标志物若能应用于临床，可尽早发现疾病并进行干预治疗。

1.1外周血中外泌体微RNA的检测

外泌体是细胞与细胞间传递信息的膜性囊泡，可携带小分子物质在体液中传播。外泌体微RNA（microRNA，miRNA）可通过血-脑脊液屏障进入外周血，为研究AD早期标志物提供更有益的价值。Yang等[2]研究发现外泌体miR-193b在AD患者血清中低表达，而外泌体miR-135a和外泌体miR-384在AD患者血清中高表达，三者联合应用早期检测AD的准确性优于单独应用。另有研究发现，外泌体miR-132、miR-212在AD和轻度认知障碍患者血浆中检测到低表达水平，与脑脊液中高水平的Aβ42存在相关性，提示外泌体miR-132和miR-212是诊断AD的潜在标志物[3]。然而，外泌体miRNA只是作为一种潜在的早期诊断生物标志物，能否应用于临床仍需大量研究。

外泌体分离常采用的方法有超速离心法、聚合沉淀法和试剂盒提取法等，这些方法因单独使用时具有成本高、纯度低、不适合大规模分离等缺点，受限于临床应用。Zhao等[4]通过离心微流控技术检测外周血中的外泌体，发现该方法速度快、效率高、价格便宜，是临床筛选外泌体的实用性方法。外泌体分离后，使用总外泌体miRNA提取试剂盒进行分离提取，最后使用实时荧光定量聚合酶链反应或高通量技术对外泌体miRNA进行评估。微流控技术可提高外泌体分离效率，电化学发光、表面等离子共振等技术也是检测外泌体miRNA的方法[5]。综上，虽有新型的高效分离外泌体及外泌体miRNA检测的技术，但能否用于临床血液检测仍属未知，只能在现有的检测方法基础上进行摸索和改进。

1.2载脂蛋白E4与AD相关神经丝蛋白的检测

载脂蛋白E（apolipoproteinE，ApoE）是中枢神经系统中参与脂质代谢的重要胆固醇载体，ApoE基因有E2、E3和E4三种常见的等位基因型。其中，ApoE4被认为是导致AD发生的最强风险因子。ApoE4的存在并不一定直接导致AD的发生发展，但这种遗传亚型的存在可加速疾病进程。研究发现ApoE4对AD发生风险的影响主要通过抑制Aβ清除及促进Aβ聚集，Aβ的积聚正是导致AD发生的病理特征之一[6]。AD相关神经丝蛋白（Alzheimer-associatedneuralthreadprotein，AD7c-NTP）是一种跨膜磷脂蛋白，该蛋白的表达可导致神经元的凋亡和神经炎的发生。研究发现AD的严重程度与AD7c-NTP水平呈正相关，0.94ng/ml的AD7c-NTP可区分AD和轻度认知障碍[7]。AD患者尿液中可检测到AD7c-NTP，极大可能是由于脑组织中的AD7c-NTP通过血-脑脊液屏障进入外周血，再经肾小球滤过并经尿液排出。ApoE4虽是AD的危险因素之一，但其单独诊断AD的能力有限，特异性和敏感度较低。ApoE4与AD7c-NTP联合检测可进一步提高AD诊断的准确性，弥补单独应用的不足。

ApoE4的血液检测可应用核酸提取试剂盒收集DNA，再通过荧光定量聚合酶链反应进行DNA扩增，最后将其与基因芯片上的特异性核酸探针进行杂交，确定ApoE4基因型。应用酶联免疫吸附分析技术可检测患者尿液中的AD7c-NTP，该方法取样具有无创性，易被患者接受，更适合临床应用。目前，ApoE4检测由检验科完成，方法较为成熟；而尿液AD7c-NTP检测试剂盒只能用于科学研究，是否可应用于临床仍有待证实。

1.3β位点淀粉样前体蛋白裂解酶1及其反义转录物的检测

β位点淀粉样前体蛋白裂解酶1[β-siteamyloid-βprecursorprotein（AβPP）cleavingenzyme1，BACE1]是一种可将淀粉样前体蛋白催化为Aβ的酶，Aβ的形成及清除失衡是导致AD发生的原因之一。AD患者血浆中的BACE1水平高于健康人群。血浆中的BACE1活性测定具有高特异性和高敏感度，可作为诊断AD的早期标志物。轻度认知障碍患者脑脊液中的BACE1活性高于健康对照者[8]；表明BACE1的生成可作为AD的早期标志物之一。

另外，BACE1-反义转录物（antisensetranscript，AS）是一种长链非编码RNA。BACE1-AS可促进BACE1的生成。与其他反义转录物不同，BACE1-AS不是与BACE1信使RNA的互补区域互补抑制其信使RNA的翻译，而是增强其稳定性，从而产生ce85019253bd3741e6d65ebbacd91be123c73ddecb53789faf5a278414d1db7c更多的Aβ[9]。AD患者血浆中的BACE1-AS水平远高于健康人群，可作为诊断AD的新型血液生物标志物[10-11]。

已有研究将氧化石墨烯还原为还原氧化石墨烯，再涂抹在掺氟氧化锡载玻片上，最后使BACE1抗体固定在载玻片上，用于检测BACE1抗原[12]。该方法检测速度快，敏感度和特异性较高，可用于临床BACE1的检测。外周血中BACE1-AS的检测主要通过提取血浆总RNA，反转录后进行聚合酶链反应扩增，最后进行电泳和产物测序。BACE1表达水平的增加虽是引发AD的因素之一，但BACE1始终是一种蛋白生物标志物。BACE1-AS作为一种分子标志物刚好可弥补蛋白生物标志物的不足，更能够早期诊断AD。二者若能联合使用，将更有利于AD的早期判断。

1.4其他标志物的检测

当满足一定条件时，不仅尿液中可检测到AD的早期标志物，唾液中也可检测出相关标志物[13]。但由于唾液中杂质较多，对检测条件要求更高，不易于标志物的检测。另外，在AD标志物检测方面，生物传感器因其检测速度快、较为特异且敏感，近几年被越来越多地用作血液和唾液中AD标志物的检测[14]。此外，视网膜变化是早期诊断AD和监测疾病进展的潜在生物标志物，光学相干断层成像技术常用于早期AD患者的筛查[15]。

2PD早期标志物的检测

PD也是一种常见的与年龄有关的神经系统退行性疾病，发病率仅次于AD。除部分PD的发生由基因突变引起，大部分PD的发病机制目前还不清楚。PD主要的病理特征包括中脑黑质致密部多巴胺能神经元凋亡和路易小体的形成。2015年调查结果显示，中国社区人口中PD患者数估计高达362万例[16]。PD患者也常在神经元完全退化后才出现临床表现，错失最佳治疗时间，且治疗方案较少，价格昂贵，不易被大众接受。因此，早期检测、及时干预成为当前PD治疗的一项重要且艰巨的任务。

2.1α-突触核蛋白的检测

α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）是构成路易小体的主要成分。α-syn的过表达和异常聚集可形成具有神经毒性的寡聚体，致使神经元受到毒性损伤[17]。α-syn寡聚体的形成先于神经元损伤。研究表明PD患者外周血中α-syn主要在疾病发生的早期阶段升高，可作为诊断PD的早期标志物[18]。此外，脑脊液、胃肠道和血浆外泌体中的α-syn都有作为诊断PD的早期标志物的潜能。

目前，国内有实验室建立基于荧光免疫分析技术检测鼠血浆中129位丝氨酸磷酸化α-syn水平的方法，该方法的敏感度和特异性较高，可为在人体中检测α-syn提供参考方法[19]。还有实验室使用新型电化学、光化学技术和生物传导器对α-syn进行检测，虽然生物传感器具有成本低、敏感度高的优点，但该方法目前仅用于实验室研究，对检测临床样本中微量和形态较为复杂的α-syn的通用性和实用性仍有待提高[20]。

2.2外泌体miRNA的检测

PD患者血液中分离出的外泌体miRNA有可能成为PD进展研究的重要标志物。为证实这一点，研究者通过收集PD患者血清外泌体分析后发现，血清外泌体has-miR-22-5p、has-miR-151a-5p等miRNA可作为PD早期诊断的生物标志物[21]。虽然越来越多的外泌体miRNA通过RNA测序和生物信息学等方法进行检测，但外泌体miRNA检测方法的金标准仍为逆转录-定量聚合酶链反应。近年来，场效应晶管体生物传感器因其高精密度和免标记的特点被广泛用作核酸等早期标志物的检测，但场效应管功能化方法较为单一，限制了检测的敏感度，在临床上的应用也存在一定的挑战[22]。

2.3神经丝轻链的检测

神经丝轻链（neurofilamentlightchain，NFL）是神经丝正常神经元结构的一部分。神经元损伤可导致NFL释放到脑脊液和血液中，其在脑脊液和血液中的水平与各种神经系统疾病的轴索损伤程度成比例增加。由此推测NFL有望在PD患者出现典型临床症状前或神经元发生轻微损伤时被检测到，可作为早期诊断PD的标志物。电化学发光的新型夹心免疫测定法虽可定量检测血液和脑脊液中的NFL，但单分子免疫阵列（singlemoleculearray，Simoa）技术的敏感度更高。脑脊液标本取材时对患者的创伤性较大，不易获取，而外周血则恰好可弥补这一缺陷。临床上已有实验室采集血浆进行Simoa检测，这一方法可极大提高检测效率，使检测结果更加准确。

2.4溶酶体酶的检测

溶酶体是真核细胞中具有降解功能的细胞器，包含60多种溶酶体酶。组织蛋白酶D被认为是降解α-syn最主要的溶酶体酶。当该溶酶体功能发生障碍时，因α-syn不能及时清除而聚集成有毒性的聚集体，损伤神经细胞，最终导致神经变性。提高组织蛋白酶D活性不仅可增强大脑神经元及α-syn的清除率，还能预防神经退行性疾病的发生。实验室检测组织蛋白酶D的方法：双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清中组织蛋白酶D水平，免疫印迹法检测尿液中组织蛋白酶D水平。虽然该标志物有诊断PD的潜能，但组织蛋白酶D的特异性不高，是否能作为PD早期检测标志物用于临床还需更多的研究进行证实。

葡糖脑苷脂酶也是溶酶体酶。葡糖脑苷脂酶对PD发生的影响较大，葡糖脑苷脂酶1突变时可导致PD的患病率风险升高20～30倍。葡糖脑苷脂酶1突变可能会导致葡糖脑苷脂酶功能丧失、α-syn聚集及清除异常[23]。因此，葡糖脑苷脂酶1基因编码的葡糖脑苷脂酶可能成为早期检测PD的生物标志物。早期检测葡糖脑苷脂酶主要使用流式细胞术测定葡糖脑苷脂酶的活性。酶联免疫吸附实验检测也被用来检测葡糖脑苷脂酶的含量。对葡糖脑苷脂酶的研究同组织蛋白酶D一样，大多在于该物质可治疗PD，特异性也不高。

虽然上述两种溶酶体酶均有作为PD早期生物标志物的潜能，但单独使用时其诊断准确度及特异性并不高，联合多种溶酶体酶共同诊断可提高检测结果的特异性，使诊断结果更加可靠。

3小结与展望

衰老是神经退行性疾病主要的危险因素之一，这对老年患者的身体健康极其不利，对家庭和社会也是极大的挑战[24]。VASOkOogamA5Z4aKRyN61A==在神经退行性疾病确诊时，患者的身体已出现不可逆性损伤。家属不仅需要付出大量的时间和精力照顾患者，患者在生活中也异常痛苦和不便。为避免这种情况的发生，越来越多的研究团队把目光集中于神经退行性疾病的早期研究。在疾病发生的早期快速确诊，可很好地预防和减缓疾病的发生、发展。

研究表明血液和脑脊液中的生物标志物具有早期诊断疾病的价值[25]。多种脑脊液的生物标志物联合诊断神经退行性疾病已成为一种较好的诊断方法。同时，将血液标志物用于诊断神经退行性疾病也被认为是一种侵袭性较小、可为大多患者接受并广泛适用于临床的方法。利用价格昂贵的仪器和技术或通过侵袭性手段诊断神经退行性疾病非长久之计，不为大众所接受。本综述主要搜集近年来在脑脊液、血液、尿液等体液中的神经退行性疾病标志物，并分析相关检测方法，希望能为临床研究神经退行性疾病提供借鉴和帮助。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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