lncRNA SNHG 15调控miR-95-3p对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响

[摘要]目的探究长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）核仁小RNA宿主基因15（smallnucleolarRNAhostgene15，SNHG15）调控微RNA95-3p（microRNA95-3p，miR-95-3p）对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响。方法将乳腺癌细胞分为对照组、敲减组、干扰组、共转染组，体外培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。测定SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相对表达量；使用噻唑兰（methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT）法检测乳腺癌细胞增殖能力；流式细胞仪检测乳腺癌细胞凋亡情况；划痕试验检测乳腺癌细胞迁移能力；Transwell侵袭实验测定乳腺癌细胞侵袭个数；采用Westernblot法测定半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）相对表达量。结果与对照组比较，敲减组SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相对表达量及增殖能力、增殖率、迁移能力、侵袭个数、Bcl-2蛋白表达下降；凋亡情况、凋亡率、caspase-3、Bax表达升高（P<0.05）。与敲减组、干扰组比较，共转染组SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相对表达量及增殖能力、增殖率、迁移能力、侵袭个数、Bcl-2蛋白表达升高；凋亡情况、凋亡率、caspase-3、Bax表达降低（P<0.05）。与干扰组比较，共转染组SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相对表达量及增殖能力、增殖率、迁移能力、侵袭个数、Bcl-2表达升高，凋亡情况、凋亡率、caspase-3、Bax蛋白表达降低（P<0.05）。结论lncRNASNHG15可通过调控miR-95-3p表达影响乳腺癌细胞的增殖与凋亡，与乳腺癌细胞的发生、发展呈正相关。

[关键词]长链非编码核仁小RNA宿主基因15；长链非编码RNA；微小RNA95-3p；乳腺癌；增殖；凋亡

[中图分类号]R737.9[文献标识码]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.013

EffectoflncRNASNHG15inregulatingmiR-95-3pontheproliferationandapoptosisofbreastcancercells

SUNKaiting，CHIYili

OncologyDepartment，WenzhouHospitalofIntegratedTraditonalChineseandWesternMedicine，Wenzhou325000，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveToexploretheeffectoflongnon-codingRNA（longnon-codingRNA，lncRNA）smallRNAhostgene15（smallnucleolarRNAhostgene15，SNHG15）regulatingmicroRNA95-3p（miR-95-3p）onbreastcancercellproliferationandapoptosis.MethodsBreastcancercellsweredividedintocontrolgroup，knockdowngroup，interferencegroupandco-transfectiongroup.HumanbreastcancercelllineMDA-MB-231wasculturedinvitro.MeasuretherelativeexpressionlevelsofSNHG15mRNAandmiR-95-3pmRNA;Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide（MTT）wasusedtodme5kf1uzPyFZ9rWlD99Xwg==etecttheproliferationabilityofbreastcancercells;Theapoptosisofbreastcancercellswasdetectedbyflowcytometry;Themigrationabilityofbreastcancercellswasdetectedbyscratchtest;Transwellinvasiontestwasusedtomeasurethenumberofbreastcancercellsinvaded;Westernblotwasusedtodeterminetherelativeexpressionlevelsofcaspase-3，B-celllymphoma-2（Bcl-2），andBcl-2associatedXprotein（Bax）.ResultsComparedwithcontrolgroup，therelativeexpressionlevelofSNHG15mRNAandmiR-95-3pmRNA，proliferationability，proliferationrate，migrationability，numberofinvasion，Bcl-2proteinexpressionweredecreased，buttheapoptosisstatus，apoptosisrate，caspase-3andBaxexpressionwereincreasedinknockdowngroup（P<0.05）.Comparedwithknockdowngroupandinterferencegroup，therelativeexpressionlevelofSNHG15mRNAandmiR-95-3pmRNA，proliferationcapacity，proliferationrate，migrationcapacity，numberofinvasion，Bcl-2proteinexpressionwereincreased，butapoptosisstatus，apoptosisrate，caspase-3andBaxexpressionweredecreasedinco-transfectiongroup（P<0.05）.Comparedwithinterferencegroup，therelativeexpressionlevelofSNHG15mRNAandmiR-95-3pmRNA，proliferationability，proliferationrate，migrationability，numberofinvasion，Bcl-2proteinexpressionwereincreased，butapoptosisstatus，apoptosisrate，caspase-3andBaxexpressionweredecreasedinco-transfectiongroup（P<0.05）.ConclusionlncRNASNHG15canaffecttheproliferationandapoptosisofbreastcancercellsbyregulatingmiR-95-3pexpression，andispositivelyassociatedwiththeoccurrenceanddevelopmentofbreastcancercells.

[Keywords]Longnon-codingnucleolarsmallRNAhostgene15;Longnon-codingRNA;microRNA95-3p;Breastcancer;Proliferation;Apoptosi

乳腺癌是女性肿瘤中最常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升，为现阶段严重威胁女性生命安全的疾病之一，因此，寻求治疗乳腺癌的有效靶点非常重要[1]。长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）核仁小RNA宿主基因15（smallnucleolarRNAhostgene15，SNHG15）在多种恶性肿瘤中呈高表达状态，具有一定的促癌作用，但目前对其在乳腺癌中的表达研究较少[2]。miRNA是一种新发现的微小单链RNA，通过转录调控基因表达[3]。研究表明miRNA对乳腺癌的发生发展起重要作用，微RNA95-3p（microRNA95-3p，miR-95-3p）在乳腺癌中呈高表达状态，具有促癌作用[4]。随着患者病情的加重，miR-95-3p表达量增高，下调表达后，可使瘤细胞的增殖侵袭能力下降，调控凋亡情况，但具体机制尚未明确[5]。基于此，本文将研究lncRNASNHG15调控miR-95-3p对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象人乳腺癌细胞系MDA-MB-231购自美国ATCC细胞库。本研究经温州市中西医结合医院伦理委员会审批通过（伦理审批号：2023-L087）。

1.1.2实验试剂SNHG15抑制剂、SNHG15、miR-95-3p转染试剂购自南通百奥迈科生物技术有限公司（批号：210823、220114、211216）；胎牛血清RPMI1640培养液、Lipofectamine2000试剂盒、噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT）溶液购自武汉普诺赛生命科技有限公司（批号：201225、211118、210412）；TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒购自上海恒远生物有限公司（批号：220826、210925）；结晶紫染色液购自厦门海标科技有限公司（批号：211125）；Matrigel凝胶购自上海钰博生物科技有限公司（批号：220112）；BCA蛋白定量试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司（批号：211215）；半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）抗体、标记的免疫球蛋白（immunoglobulinG，IgG）购自美国GeneCopoeia公司（批号：210817、221105、201214、191214）。

1.1.3仪器设备CO2培养箱购自松下健康医疗器械（上海）有限公司；流式细胞仪购自常州必达科生物科技有限公司；PCR仪购自北京中西华达科技有限公司；光学显微镜购自上海广密公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养分组转染方法将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231复苏后，放置于含有10%胎牛血清RPMI1640培养液中，需在37℃、95%湿度饱和、5%体积分数CO2培养箱内常规培养。当MDA-MB-231进入对数生长期时，将其接种于6孔板内，观察细胞汇合度达到70%进行质粒转染。转染过程需严格按照Lipofectamine2000试剂盒说明书操作，转染过程中将其分为对照组、敲减组、干扰组、共转染组。对照组采用si-NC转染，敲减组采用si-SNHG15抑制剂转染，干扰组采用anti-NC+miR-95-3p转染，共转染组采用si-SNHG15+miR-95-3p转染。各组转染后进行24h的培养。后续所有试验均重复3次，取均值。

1.2.2SNHG15、miR-95-3pmRNA相对表达量检测使用TRIzol试剂盒提取MDA-MB-231细胞总RNA，采用紫外分光光度法检测提取后的总RNA浓度，检查RNA完整性，将总RNA通过逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到cRNA，进行定量反转录聚合酶链反应（quantitativereversetranscriptase-mediatedpolymerasechainreaction，qRT-PCR）试验，将Rox、ddH2O、p1、p2、cRNA加入孔内，稀释cRNA，置于PCR仪，上机检测，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）为内参采用2-ΔΔCt方法计算SNHG15、miR-95-3p相对表达量。

1.2.3检测MDA-MB-231增殖能力MDA-MB-231细胞稳定转染后，使用MTT法进行检测，按照密度2×104个/ml放置于96孔板内，将细胞悬液接种于孔内，在CO2培养箱内常规培养，分别于24h、48h、72h时间点，在孔内加入MTT溶液培养4h后，使用DMSO进行显色，观察在波长450nm处的吸光度（opticaldensity，OD）值，以此判断细胞的增殖能力。细胞增殖率=（早期细胞增殖数+晚期细胞增殖数）/总细胞数×100%。

1.2.4检测MDA-MB-231凋亡情况MDA-MB-231细胞稳定转染后，采用流式细胞仪于24h、48h、72h时间点检测MDA-MB-231细胞凋亡情况，使用4%多聚甲醛固定MDA-MB-231细胞1h，在37℃条件下，于H2O2中孵育30min，磷酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗涤，离心后进行细胞计数，调整细胞浓度，加入缓冲液、碘化丙啶（propyliodide，PI）、荧光异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）与膜联蛋白V（annexinV）标记后取细胞悬液，在摇床上避光孵育20min，上机检测。细胞凋亡率=（早期细胞凋亡数+晚期细胞凋亡数）/总细胞数×100%。

1.2.5检测MDA-MB-231迁移能力MDA-MB-231细胞稳定转染后，通过划痕试验检测其迁移能力。在6孔板内，取2×103个细胞培养过夜，移液枪垂直划线，冲洗，分别培养0h、24h取出，观察划痕愈合状态，在显微镜下观察并计算细胞迁移数值。

1.2.6检测MDA-MB-231侵袭个数MDA-MB-231细胞稳定转染后，进行Transwell侵袭实验。在每个Transwell小室底面均匀涂抹纤维连接蛋白，固化。将MDA-MB-231细胞在4℃条件下，于CO2培养箱内Matrigel凝胶过夜，在上、下室分别加入细胞悬液、10%胎牛血清的培养基，培养箱内恒温培养24h，将Transwell小室取出，使用PBS进行清洗，放入乙醇溶液中固定，结晶紫染色液中染色，拭去滤膜上层细胞后在显微镜下观察。

1.2.7测定caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量MDA-MB-231细胞稳定转染后，使用Westernblot法检测caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量。使用裂解液进行裂解，分离蛋白后，用BCA法检测蛋白浓度。蛋白经变性后转膜，封闭，加入稀释后的一抗，在4℃条件下，孵育过夜；加入二抗，孵育1h；使用增强化学发光法（enhancedchemiluminescence，ECL）发光显影，检测蛋白；以GAPDH为参照，计算蛋白表达量。

1.3统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件对数据进行处理分析。用Kolmogorov-Smirnov检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间两两比较采用独立t检验，计量资料多组间比较采用F检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相对表达量比较

与对照组相比，敲减组SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相对表达量降低，干扰组、共转染组SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与敲减组、干扰组相比，共转染组SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相对表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2各组MDA-MB-231增殖能力比较

与对照组相比，敲减组增殖能力降低，干扰组、共转染组增殖能力升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与敲减组、干扰组相比，共转染组增殖能力升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2；各组细胞的增殖情况见图1。

2.3各组MDA-MB-231细胞凋亡情况比较

与对照组相比，敲减组MDA-MB-231细胞凋亡数升高，干扰组、共转染组凋亡数降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与敲减组、干扰组相比，共转染组凋亡数降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表3；各组细胞凋亡情况见图2。

2.4各组MDA-MB-231细胞增殖率、凋亡率比较

与对照组相比，敲减组MDA-MB-231细胞增殖率降低，凋亡率升高，干扰组、共转染组增殖率升高，凋亡率降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与敲减组、干扰组相比，共转染组增殖率升高，凋亡率降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表4；各组细胞增殖、凋亡情况比较见图3。

2.5各组MDA-MB-231细胞迁移、侵袭能力比较

与对照组相比，敲减组MDA-MB-231细胞迁移、侵袭个数降低，干扰组、共转染组迁移、侵袭个数升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与敲减组、干扰组相比，共转染组MDA-MB-231细胞迁移、侵袭个数升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表5；各组细胞迁移、侵袭能力比较见图4。

2.6各组MDA-MB-231线粒体凋亡蛋白表达比较

与对照组相比，敲减组caspase-3、Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，干扰组、共转染组caspase-3、Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与敲减组、干扰组相比，共转染组caspase-3、Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表6、图5。

3讨论

乳腺癌是女性第一高发恶性肿瘤，随着生活水平的提高，其发病率逐年提高，其发生诱因多认为与基因、家族等因素有关[6]。但目前尚未明确影响其发展的分子机制，由于对理解乳腺癌的发生不够全面，临床治疗效果并不理想[7]。现已证实lncRNASNHG15与多种癌症的发生发展密切相关，在多种恶性肿瘤中表达异常，如结直肠癌、肺癌、乳腺癌等[8]。本研究认为lncRNASNHG15可能在乳腺癌中具有重要作用，但具体机制尚未阐明，因此，本文通过研究lncRNASNHG15调控miR-95-3p观察对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响，以便对乳腺癌防治进行更有效的临床指导，控制乳腺癌的复发率、致死率，提高预后效果。

目前miR-95-3p在肿瘤中的研究较少，但miR-95-3p在多种恶性肿瘤中表达处于异常状态[9]。miR-95-3p在乳腺癌机体内属于促癌因子，其表达增强可显著提高癌细胞的增殖转移，减少凋亡，增强癌细胞周期的发展[10]。在机体产生癌变时，miR-95-3p可对癌细胞的增长与凋亡进行调控，加快癌细胞的发展速度[11]。本研究进一步探究lncRNASNHG15对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响，结果显示SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA相对表达量出现上调，且对SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA的表达进行分组可知，抑制lncRNASNHG15含量，SNHG15mRNA、miR-95-3pmRNA表达均降低，上调lncRNASNHG15、miR-95-3p，其蛋白含量显著升高。本研究与岳成旭等[12]研究结果一致，表明抑制lncRNASNHG15可降低乳腺癌细胞的增殖能力，促进其凋亡发生。

相关研究指出，lncRNASNHG15可能在转录后发挥调控作用，通过影响下游基因表达，影响癌细胞的增殖与凋亡[13]。本研究发现，lncRNASNHG15与miR-95-3p存在明显的正相关关系，干扰lncRNASNHG15表达后，可显著降低miR-95-3p表达，降低增殖能力，加快癌细胞凋亡；提高lncRNASNHG15、miR-95-3p表达水平，可显著提高乳腺癌细胞增殖率，降低癌细胞凋亡率。由此得出，lncRNASNHG15可能存在对乳腺癌细胞增殖、凋亡的调控，可达到相关研究治疗效果[14]。本研究还证实通过控制lncRNASNHG15、miR-95-3p表达水平可有效调控癌细胞的侵袭、转移，lncRNASNHG15水平降低，乳腺癌细胞迁移能力降低、侵袭个数减少；lncRNASNHG15水平升高，其迁移能力升高、侵袭个数增多。在lncRNASNHG15高水平情况下，miR-95-3p含量也呈现高表达状态[15]。

caspase-3、Bax、Bcl-2参与癌细胞凋亡过程并发挥关键作用[16]。caspase-3表达水平升高可促进癌细胞凋亡[17]；Bax促进癌细胞凋亡，Bcl-2抑制癌细胞凋亡，二者对癌细胞的生存发展具有重要作用[18-19]。研究结果显示caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白在乳腺癌细胞中均呈现异常状态，敲减lncRNASNHG15水平可明显提高caspase-3、Bcl-2水平，降低Bax水平，加快癌细胞凋亡；提高lncRNASNHG15水平可导致caspase-3、Bcl-2水平降低，Bax水平升高，降低癌细胞凋亡，使癌细胞得以发展。本研究与吴坤琳等[20]研究具有一致性，表明caspase-3、Bax、Bcl-2可对乳腺癌细胞的增殖、凋亡产生重要影响。

综上，lncRNASNHG15通过调控miR-95-3p表达对乳腺癌细胞的增殖、凋亡产生影响，敲减lncRNASNHG15可降低乳腺癌细胞增殖能力、提高凋亡率，明确lncRNASNHG15、miR-95-3p与癌细胞的正相关关系，可进一步明确lncRNASNHG15在乳腺癌细胞中的作用，为临床治疗乳腺癌提供一定依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2023–12–01）

（修回日期：2024–07–08）