神经肽S受体基因多态性与原发性失眠的相关性研究

[摘要]目的探讨神经肽S受体（neuropeptideSreceptor，NPSR）基因单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位点（rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547、rs324957）与原发性失眠（primaryinsomnia，PI）的相关性。方法选取2016年12月至2019年5月在甘肃省人民医院睡眠医学中心门诊就诊并确诊的PI患者157例作为PI组，选取同期133名健康体检者作为对照组。抽取受试者的静脉血标本，并提取DNA、聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增、琼脂糖凝胶电泳，目标位点测序对rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547、rs324957单核苷酸位点进行基因分型，同时行标准多导睡眠监测，分析基因多态性与PI的相关性。结果两组受试者的NPSRSNP位点（rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547）基因型分布和等位基因频率及rs324957等位基因频率的差异均无统计学意义（P>0.05）；rs324957位点基因型分布差异有统计学意义（P=0.034）；两组受试者不同单倍型频率差异无统计学意义（P>0.05）。结论NPSRrs324957SNP位点基因型表达或与PI相关，且以AG基因型为主。

[关键词]神经肽S；原发性失眠；单核苷酸多肽性

[中图分类号]R749；R596[文献标识码]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.001

StudyonthecorrelationbetweenneuropeptideSreceptorgenepolymorphismandprimaryinsomnia

FANJie1，2，HUIPeilin1，2，MAWei1，2，WANGXubin1，2，ZHAOYuan1，2，WANGJinfeng1，2，CHENXueping1，2，SUXiaoyan1，2，GUOBin1，2，XIEYuping1，2

1.CenterofSleepMedicine，GansuProvincialPeople’sHospital，Lanzhou730000，Gansu，China;2.GansuClinicalSleepMedicineResearch Center，Lanzhou730000，Gansu，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethecorrelationbetweenneuropeptideSreceptor（NPSR）singlenucleotidepolymorphism（SNP）（rs323917，rs323920，rs323922，rs2530547，rs324957）andprimaryinsomnia（PI）.MethodsAtotalof157patientsdiagnosedwithPIintheoutpatientdepartmentofCenterofSleepMedicine，GansuProvincialPeople’sHospitalfromDecember2016toMay2019wereselectedasPIgroup，and133healthyphysicalexaminationsubjectsduringthesameperiodwereselectedascontrolgroup.VenousbloodsampleswerecollectedandDNA，polymerasechainreaction（PCR）amplificationandagarosegelelectrophoresiswereextracted.rs323917，rs323920，rs323922，rs2530547，rs324957singlenucleotidelociweregenotypizedbytargetsitesequencing.Meanwhile，standardpolysomnosismonitoringwasperformedtoanalyzethecorrelationbetweengenepolymorphismandPI.ResultsTherewerenosignificantdifferencesinthegenotypedistributionofNPSRSNPsites（rs323917，rs323920，rs323922，rs2530547）andallelefrequencyandrs324957allelefrequencybetweentwogroups（P>0.05）.Therewassignificantdifferenceingenotypedistributionofrs324957（P=0.034）.Therewasnosignificantdifferenceinthefrequencyofdifferenthaplotypesbetweentwogroups（P>0.05）.ConclusionTheexpressionofrs324957SNPgenotypesinNPSRmayberelatedtoPI，andAGgenotypeisdominant.

[Keywords]NeuropeptideS;Primaryinsomnia;Singlenucleotidepolymorphism

失眠是一种常见的睡眠障碍，分为原发性失眠（primaryinsomnia，PI）和继发性失眠。PI几乎以睡眠障碍[难以进入睡眠和（或）难以维持或睡眠后精力不能恢复]为唯一的症状，尽管有足够的睡眠时间，但仍会出现睡眠问题，并导致至少一种相关的日间障碍，影响社交、工作或其他重要领域，每周至少发生3次，持续时间>3个月，并排除由其他心理/精神障碍及躯体疾病、药物或酒精等导致的失眠[1]。关于PI的成因，有研究发现PI患者有家族聚集现象[2]。Beaulieu-Bonneau等[3]对953例成人患者的调查显示，35%的患者至少有一个一级亲属曾罹患或正罹患失眠，提示PI具有遗传特征[4]。神经肽S（neuropeptideS，NPS）及神经肽S受体（neuropeptideSreceptor，NPSR）是最新发现的一种睡眠调节系统，它们可激活下丘脑后部组胺能、食欲素能神经元产生觉醒，这为深入研究失眠的发病机制提供新的思路[5-6]。

本研究通过选择NPSR基因的5个标签单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位点rs323917、rs323920、rs323922、rs324957及rs2530547进行基因分型，探讨PI与基因多态性的关系，为PI诊断和治疗提供一定的理论基础。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年12月至2019年5月在甘肃省人民医院睡眠医学中心门诊就诊并确诊的PI患者157例作为PI组，选择年龄、性别与PI组相匹配且保证两组间无血缘关系的133名健康体检者作为对照组。对两组受试者进行红外线音视频同步记录整夜多导睡眠监测（audioandvideopolysomnosis，AV-PSG），受试者监测当晚不服用睡眠药物，按平时作息时间进入监测室，整夜多导睡眠监测（polysomnosis，PSG）记录的时间不低于7h。多导睡眠图指标包括清醒期（W期）、非快速眼动1期（N1期）、非快速眼动2期（N2期）、非快速眼动3期（N3期）、快速眼动期（R期）。本研究经甘肃省人民医院伦理委员会审批通过（伦理审批号：syll20150043）。所有受试者均签署知情同意书。

病例组纳入标准：①符合《精神障碍诊断与统计手册》[1]第5版的PI诊断标准，至少满足以下1项：a.入睡困难；b.维持睡眠困难，表现为频繁觉醒或醒后难以入睡；c.早醒且不能再入睡。②每周睡眠困难≥3次。③失眠不是因某种物质（如滥用毒品、药物）等导致的生理效应。排除标准：①由其他原因引起的继发性失眠，尤其是根据《中国失眠症诊断和治疗指南》[7]鉴别排除焦虑障碍所致失眠；②有其他严重躯体疾病者，如高血压病、心脏病、甲状腺功能异常、糖尿病等；③有其他明确的失眠原因，如近期有重大心理应激而致失眠者；④不适合量表评估的低龄和高龄人群；⑤PSG结果为主观性失眠患者；⑥PSG结果呼吸暂停低通气指数（apnea-hypopneaindex，AHI）>15次/h者；⑦有与国外种族联姻家族史者；⑧未签署知情同意书者。对照组纳入标准：①年龄、性别与PI组相匹配正常人群；②两组间无血缘关系。

1.2方法

1.2.1SNP位点的选择从美国国立生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）SNP数据库及HapMap计划选择NPSR基因功能性SNP。纳入标准：①外显子区能改变氨基酸表达，在中国人群中最小等位基因频率>5%；②在非翻译区，中国人群中最小等位基因频率>5%；③在5'启动子2kb内，中国人群中最小等位基因频率>5%。共得到13个标签SNP，本研究选择5个标签SNP位点。

1.2.2标本采集和DNA提取采集受试者外周静脉血2ml用以提取DNA。

1.2.3引物设计及合成5个SNP位点的引物序列5个SNP位点的引物序列见表1。

1.2.4聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增目的片段将扩增产物送往博淼生物科技（北京）有限公司进行测序，测序结果用chromas软件进行分析处理。

1.3统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件对数据进行处理分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，比较采用c2检验；采用SHEsis软件在线检测基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinbergequilibrium，HWE）检验，单倍型分析及连锁不平衡检验分析5个标签SNP是否具有独立代表意义；行×列表c2检验比较组间单个基因型及等位基因频率。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组受试者的一般资料比较

两组受试者的性别、年龄、体质量指数（bodymassindex，BMI）比较，差异无统计学意义（P>0.05）；睡眠效率、总睡眠时间、睡眠持续时间、睡眠觉醒次数、N1期占比、N2期占比、N3期占比、R期占比比较，差异有统计学意义（P<0.001），见表2。

2.2HWE检验

本研究所选取的5个标签SNP位点已在HapMap中国汉族人群基因数据库中进行连锁不平衡筛查，为防止偏倚，对入选的5个标签SNP再次进行HWE检验，结果显示P>0.05，5个SNP位点基因型符合HWE，样本具有群体代表性。

2.3两组受试者的5个SNP位点基因型和等位基因频率分布

两组受试者的rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547位点基因型分布和等位基因频率及rs324957等位基因频率的差异均无统计学意义（P>0.05）；rs324957位点基因型分布差异有统计学意义（P=0.034）；两组受试者不同单倍型频率差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

2.45个SNP位点连锁不平衡检验分析

应用基于最大似然算法的SHEsis软件进行连锁不平衡检验分析，发现由rs323920-rs323922构成的单倍型高度连锁（D'>0.9，r2>0.8），见图1和图2。

2.5两组受试者的5个SNP位点组成的常见单倍型频率比较

同样应用基于最大似然算法的SHEsis软件进行单倍型推断，比较两组受试者不同单倍型频率的差异。两组受试者5个标签SNP位点组成的常见单倍型（单倍型频率>5%）有7种，P>0.05，见表4。

3讨论

NPS是一种新型的20种氨基酸肽，主要在中枢神经系统和内分泌组织中表达，NPS与NPSR特异性结合，是一种G蛋白偶联受体[8]。NPSR前体mRNA在中枢神经系统中广泛表达，包括大鼠的运动皮质、梨状皮质、前嗅核、丘脑、下丘脑、杏仁核及海马结构下托复合体等[9]。NPSR的广泛分布暗示NPS-NPSR系统在多种生理活动中发挥重要的调节作用[10]。动物研究表明，NPS-NPSR系统具有明显的促觉醒作用，主要表现为延长睡眠潜伏期、减少觉醒向慢波睡眠的转换次数、相应增加觉醒时间、缩短慢波睡眠和快速眼动睡眠时间[11-12]。研究表明将NPS输注到双侧前下丘脑，包括腹外侧视前区（ventrolateralpreopticarea，VLPO）可显著增加清醒发作的持续时间，并特别减少非快速眼动睡眠，这表明NPS通过抑制VLPO中促进睡眠的神经元诱导清醒[13]。NPSR的基因突变抑制啮齿类动物的睡眠，然而，睡眠需求依然存在，这些动物没有表现出与睡眠障碍相关的记忆障碍[14]。以上结果表明NPS的促醒作用在不同物种之间是一致的。总之，基于NPS-NPSR与睡眠相关性基础研究结论已较为一致，但关于NPSR基因研究较少，目前关于研究多态性位点与PI的致病机制尚无统一定论，少量研究显示NPSR基因的突变可导致人类原发性失眠，SNP变异导致人类睡眠变化[15]。以往研究证明遗传因素是睡眠障碍的主要因素之一；双胞胎研究表明睡眠特征和失眠有遗传基础[17]；PI患者的一级亲属患失眠的风险增加6.65倍[16-17]；成人自我报告睡眠时间和失眠的遗传率分别为0.25%～0.44%和0.22%～0.59%[18-19]。尽管有证据表明存在相当大的遗传成分（遗传率为38%～59%），但迄今为止，只有少数遗传基因座可调节失眠的风险[20]。针对失眠主诉（n=113006）的全基因组关联研究证明其多基因结构，并涉及3个全基因组显著性基因座和7个基因[21-22]。

本研究团队前期关于NPSR基因多态性和原发性失眠之间关联的研究结果表明，两种不同的等位基因组合（CATGTC和GCCAAT）可能是原发性失眠的致病因素[23]。NPS基因多态性rs323920位点和rs324957位点可能是原发性失眠的易感基因位点，NPSR-SNP位点CACGGTCCCCAGC单倍型组合为原发性失眠人群的危险基因[24]；而笔者通过对NPSR基因的5个SNP位点进一步研究，发现4个位点基因型分布和等位基因频率及rs324957等位基因频率差异均无统计学意义，但rs324957基因型分布差异有统计学意义，在PI患者中rs324957位点基因型以AG型为主，因此NPSR基因rs324957位点多态性可能与PI具有相关性，即本研究进一步证实NPSR基因多态性rs324957与汉族PI的关系，发现NPSR基因多态性rs324957的等位基因和基因型频率分布在PI组与对照组之间及两组不同性别间的显著差异，支持rs324957SNP是PI易感位点的假设。

综上所述，本研究在前期研究基础上进一步发现NPSR基因多态性SNP位点rs324957与PI之间的相关性，但仍需高质量、大样本量的研究进一步验证。未来通过增加样本量对NPSR基因位点进行筛选及研究，有望进一步丰富PI发生机制与基因多态性之间的关系，从而指导临床。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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