响应面法优化超声辅助提取烟叶废渣蛋白工艺条件

摘 要：烟叶废渣提取蛋白是其综合利用途径之一，超声辅助碱提有助于获得更多的烟叶废渣蛋白。在单因素试验基础上，采用响应面法优化烟叶废渣超声辅助提取蛋白工艺。结果表明：当缓冲液 pH 为 10、缓冲液体积为 32.77 mL、超声温度为 70.9℃、超声时间为 46.1 min 时，烟叶废渣的蛋白提取量达（19.13±0.21）mg·g−1，相比优化前提高了 140.6%，该工艺能为再造烟叶脱蛋白提供技术参考。

关键词：烟叶废渣；响应面法；超声提取；废物利用；烟叶蛋白

中图分类号：TS49 文献标志码：A

文章编号：0253−2301（2024）05−0043−06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.05.008

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Process Conditions of Protein from Tobacco Waste Residue by Response Surface Methodology

LIAO Kuan-qi1，DING Ning3，NIE Li-xuan2，JIANG Zhen-kun2，LI Lin-wei1， LU Bin4，ZHOU Kang-xi2，CHEN Yu-zhou1 ＊

（1. Xiamen Tobacco Industrial Co.， Ltd.， Xiamen， Fujian 361026， China; 2. China Tobacco Fujian Industrial Co.， Ltd.，Xiamen， Fujian 361021， China; 3. Longyan Tobacco Industrial Co.， Ltd.， Longyan， Fujian 364000， China;4. Xiamen Tongxian Industrial Co.， Ltd.， Xiamen， Fujian 361021， China）

Abstract： The extraction of protein from tobacco waste residue is one of its comprehensive utilization ways. The ultrasonic-assisted alkaline extraction is helpful to obtain more protein from the waste residue tobacco leaves. On the basis of single factor experiment， the response surface method was used to optimize the ultrasonic-assisted extraction process of protein from the waste residue of tobacco leaves. The results showed that： when the pH of buffered solution was 10， the volume of buffered solution was 32.77 mL， the ultrasonic temperature was 70.9 °C， and the ultrasonic time was 46.1 min， the protein extraction amount of tobacco leaf waste residue reached （19.13 ± 0.21） mg·g−1， which was140.6 % higher than that before optimization. This process could provide technical reference for removing protein from the reconstituted tobacco leaves.

Key words： Tobacco waste residue；Response surface method；Ultrasonic extraction；Waste utilization；Tobacco leaf protein

烟草是一种经济价值较高的农作物[1]，除了能制作香烟外，也用于萃取高附加值的烟叶香精[2]。烟叶中含有醇类、酯类、酮类、酸类和萜烯类等多种香气成分[3−5]，这些香气成分多数水溶性较差，通常使用乙醇等安全性较高的有机溶剂进行提取[6]。但烟叶香精萃取之后，其剩余的烟叶残渣难以被有效利用。

近年来，随着再造烟叶技术的改进，烟叶废渣成为再造烟叶的原料之一，经过醇提的烟叶残渣有望被回收利用。烟叶废渣中含有丰富的蛋白质，多数蛋白质在醇提过程中会发生变性沉淀留在烟叶细胞内，在燃烧过程中会产生烧焦羽毛的臭味及苦涩、辛辣的感觉[7]，对烟草制品品质不利。在制作再造烟叶前，将烟叶废渣进行蛋白质提取，既能将处理后的废渣作为再造烟叶的纤维原料，又能将烟叶蛋白作为发酵工业或饲料工业的蛋白原料[8]，实现烟草多用途利用。基于此，本研究在单因素优化的基础上，采用响应面法优化烟叶废渣超声提取蛋白质的工艺条件，为再造烟叶脱蛋白提供技术参考，也为烟叶蛋白的多用途利用提供原料供给。

1 材料与方法

1.1 供试材料

烟叶废渣：津巴布韦片烟经乙醇提取烟叶香精后的残渣，由福建中烟工业有限责任公司提供；HCl、NaOH、三羟甲基氨基甲烷（Tris）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，所用 Tris 缓冲 液 均 用 蒸 馏 水 配 制 ， 经 2 mol·L−1 的 HCl 或2 mol·L−1 的 NaOH 调至所需 pH 后再用蒸馏水将Tris 定容至 0.1 mol·L−1；总蛋白（TP）测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；S300H 型通用超声波清洗器（德国 Elma 公司）；SpectraMax®i3x 酶标仪（美国 Molecular Devices 公司）；CF16-RXII 型高速冷冻离心机（日本 Hitachi 公司）；Hei-VAP Core 型 旋 转 蒸 发 仪 （ 德 国 Heidolph 公司）；AB23 型 pH 计（美国 OHAUS 公司）；919E 型低温研磨机（余姚市海蒂诗家用电器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1烟叶废渣的预处理 取 50 g 烟叶废渣于旋转蒸发仪中 60℃ 真空旋蒸去除烟叶废渣中残留的乙醇，再将湿烟叶继续旋蒸去除水分，直至其重量不再变化，低温（≤40℃）研磨并过 40 目筛剔除大颗粒杂质获得烟叶废渣细粉。重复上述操作，直至获得 300 g 上述细粉。

1.2.2超声辅助提取烟叶废渣蛋白

（1）单因素试验

分别考察 Tris 缓冲液的 pH 及体积、超声温度及时间 4 个因素对提取烟叶废渣蛋白的影响。取0.5 g 烟叶废渣细粉于 50 mL 离心管中，初始工艺参 数 为 ： 加 入 20 mL、 pH 7.0 的 Tris 缓 冲 液 ，30℃ 超声 30 min。在单因素试验时，依次将缓冲液 pH 设置为：4、5、6、7、8、9、10、11、12；缓冲液体积设置为：10、15、20、25、30、35mL；超声温度设置为：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃；超声时间设置为：10、20 、30、40、50、60 min。通过单因素试验结果选择响应面参数优化范围。

（2）响应面试验

由单因素试验获得较佳的蛋白提取工艺参数范围，使用 Design-Expert.V8.0.6 软件中 Box-Behn ken 方法进行 4 因素 3 水平的响应面试验（表 1），根据软件设定参数进行蛋白提取和测定，将蛋白提取量作为赋值并用软件进行响应面模型拟合和最优工艺参数计算。

1.3 测定项目及分析方法

蛋白提取量的测定：将超声后的样品 10 000r·min−1、4℃ 离心 10 min，用总蛋白（TP）试剂盒测定上清液中蛋白质浓度，具体操作方法参照试剂盒说明书。蛋白质提取量的计算方法如下：

蛋白提取量=上清液蛋白浓度×缓冲液体积/废渣质量

2 结果与分析

2.1 缓冲液 pH 对烟叶废渣超声提取蛋白的影响烟叶细胞壁主要由果胶、纤维素、半纤维素、木质素构成[9] ，其中，纤维素、半纤维素和木质素主要作为结构骨架，维持细胞壁结构的完整性，而果胶作为填充介质充满其中[10] 。碱液对果胶具有破坏作用，能使果胶发生 β-消除反应，将聚半乳糖醛酸长链降解成小片段[11] ，还能使果胶发生脱酯作用[12]，打破细胞屏障，利于提取胞内蛋白。

由图 1 可知，在酸性条件下难以提高蛋白提取量，而在碱性条件下蛋白提取量明显增加，验证了碱提法通过破坏果胶来提取胞内蛋白的合理性；但当pH 值过高时（pH≥9），蛋白提取量不再增加，推测过量的碱也可能水解蛋白[13] ，需要对其进行控制。因此，选择 pH 8～10 作为响应面工艺参数优化范围。

2.2 缓冲液体积对烟叶废渣超声提取蛋白的影响

固定缓冲液 pH 为 9，对其添加体积进行单因素优化。由于试验过程中固定烟叶废渣细粉为 0.5g，缓冲液体积的变化可视为料液比的变化。当缓冲液体积增加时，料液比降低，利于稀释缓冲液中蛋白质的浓度，增加细胞内外浓度差，从而促进胞内蛋白向胞外溶出；但过低的料液比不利于后期蛋白富集。由图 2 可知，当缓冲液体积在 10～30 mL范围内时，蛋白提取量呈现上升趋势；但当缓冲液增加至 35 mL 时，蛋白提取量不再增加。因此，选择缓冲液体积 25～35 mL 作为响应面工艺参数优化范围。

2.3 超声温度对烟叶废渣超声提取蛋白的影响

水浴超声能在细胞壁周围产生空泡，进而对细胞壁有破坏作用，是破壁常用的物理方法之一[14] 。在超声过程中，温度能与超声协同作用，增强超声的破壁能力。由图 3 可知，在 30～70℃ 范围内，随着超声温度的增加，蛋白提取量逐渐增加，但当温度超过 70℃ 后，蛋白提取量不再增加。因此，选择超声温度 60～80℃ 作为响应面工艺参数优化范围。

2.4 超声时间对烟叶废渣超声提取蛋白的影响

由图 4 可知，随着超声时间的延长，烟叶废渣蛋白提取量缓慢增加，至超声 50 min 后其提取量不再增加。因此，选择超声时间 40 ～60 min 作为响应面工艺参数优化范围。

2.5 响应面优化烟叶废渣超声提取蛋白工艺

基于上述单因素试验结果及其选取的优化范围，使用 Design-Expert.V 8.0.6 软件中 Box-Behnken方法进行响应面试验设计并检测响应的试验结果（表 2），对表 2 试验结果进行模型拟合并做方差分析（表 3），拟合公式见公式（1）。由表 3 可知，模型拟合显著且失拟项不显著，说明模型拟合成功。结合表 3 及公式（1）进行分析：在一次项中，缓冲液 pH 及体积、超声温度和时间4 个因素都显著，其一次性系数为正且数值较高，说明 4 个因素都较大影响了烟叶废渣的蛋白提取量；在单因素的平方项中，它们对模型的影响都显著，说明烟叶废渣的蛋白提取量与 4 个因素之间并非呈现线性关系；在不同因素之间的交互项中，缓冲液 pH 与其他因素之间都存在交互作用，尤其与缓冲液体积之间交互作用最强，而超声温度、超声时间、缓冲液体积三者之间并不存在显著的交互作用。

Y =−73.47870+1.06829A+0.51872B+1.39712C+3.79633D−0.000746154AB−0.000417949AC −0.018769AD+0.00118462BC −0.019231BD+1.0477CD−0.00587068A2 −0.00338671B2 −0.037672C2 −0.24265D2 （1）

公式（1）中，Y 为蛋白提取量（mg·g−1）；A 为 超 声 温 度 （ ℃）； B 为 超 声 时 间 （ min）；C 为缓冲液体积（mL）；D 为缓冲液 pH。

由图 5 可知，各因素之间的响应曲面均开口向下，且多数曲面的二维投影等高线较为完整，模型的极大值可能位于曲面的极大值处。结合公式（2）进行计算可得，当缓冲液 pH 为 10、缓冲液体积为 32.77 mL、超声温度为 70.9℃、超声时间为 46.1 min 时，烟叶废渣的蛋白提取量存在极大值，为 19.03 mg·g−1。用所得最优参数进行试验验证，烟叶废渣的实际蛋白提取量为（19.13±0.21）mg·g−1，与理论计算相近。与初始提取工艺蛋白提取量（7.95±0.38）mg·g−1 相比，蛋白质提取量提高了 140.6%。

3 讨论与结论

碱提酸沉法常被用于提取烟叶蛋白，王胜优等[15]采用 pH 8.6 的磷酸缓冲液提取烟叶蛋白，其蛋白提取率为 84.95%；董二慧等[16]也用磷酸盐缓冲液提取烟叶蛋白，其 pH 为 7.48，蛋白提取量为10.96 mg·g−1。本研究在碱提的基础上，使用超声辅助提取蛋白，通过单因素试验筛选，采用响应面法优化烟叶废渣蛋白提取工艺，最优工艺条件为：缓冲液 pH 10、缓冲液体积 32.77 mL（料液比 50∶3277）、超声温度 70.9℃、超声时间 46.1 min，实际蛋白提取量达（19.13±0.21）mg·g−1，相比于初始提取工艺，蛋白提取量提高了 140.6%。

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（责任编辑：林玲娜）