高温大曲中1株产四甲基吡嗪细菌的鉴定及生物特性分析

摘 要：四甲基吡嗪是白酒中重要的风味物质，赋予了白酒的健康功效。采用稀释涂布平板法从贵州高温大曲中分离产四甲基吡嗪的细菌，通过菌落形态、显微镜观察和分子生物学方法对其进行鉴定，并对其产酶特性、生长特性及耐受特性进行研究。结果表明：从贵州高温大曲中筛选得到 1 株产四甲基吡嗪的菌株 FSDQ02，初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens，该菌能分泌蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶；能在 30～40℃ 和 pH5～9 范围内生长良好；对 6% 的乙醇和 14% 的 NaCl 具有耐受性。该研究结果分离得到的解淀粉芽孢杆菌 FSDQ02 在强化高温大曲和白酒生产中具有较大的应用潜力。

关键词：高温大曲；四甲基吡嗪；生物学特性；解淀粉芽孢杆菌

中图分类号：TS261.4

文献标志码：A

文章编号：0253−2301（2024）05−0010−06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.05.002

Identification and Biological Characteristics Analysis of a Tetramethylpyrazine-producing Bacterium from High-temperature Daqu

LAI Bao-ling1，HUANG Na-ting1，HUANG Yuan-long1，ZHANG Shou-cai2，HUANG Zu-xin1，LI Shan-ren1 ＊

（1. College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China;2. Huanghuashan Liquor-making Co. Ltd.， Jian’ou， Fujian 353100， China）

Abstract： Tetramethylpyrazine is an important flavor compound in liquor， which endows liquor with health efficacy.The bacteria that could produce tetramethylpyrazine were isolated from the high-temperature Daqu in Guizhou by using the dilution spread plate method， and were identified by using the methods such as colonial morphology，microscopic observation and molecular biology. Then， their enzyme production characteristics， growth characteristics and tolerance characteristics were studied. The results showed that one strain FSDQ02 producing tetramethylpyrazine was screened from the high-temperature Daqu in Guizhou， which was preliminarily identified as Bacillus amyloliquefaciens. The strain FSDQ02 could secrete protease， amylase and cellulase， and grow well in the range of30−40℃ and pH 5−9， with the tolerance to 6% ethanol and 14% NaCl. Bacillus amyloliquefaciens FSDQ02 isolated from the results of this study had great great application potential in strengthening the production of high-temperature Daqu and liquor.

Key words： High-temperature Daqu；Tetramethylpyrazine；Biological characteristics；Bacillus amyloliquefaciens

酱香型白酒是中国传统白酒的代表，具有酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长、空杯留香持久等特点，受到白酒消费者的欢迎[1−3]。高温大曲是酱香型白酒生产中重要的糖化剂和生香剂，含有大量微生物和水解酶，可以将原料中大分子物质如糖类和蛋白质等分解为小分子物质如葡萄糖和氨基酸等，为后期酒醅发酵提供丰富的底物和香味前体物质[4−6]。白酒酿造过程中，微生物的种类和数量直接关系到酱香型白酒的产量和品质[7]。通过人工添加有益的功能微生物制备强化大曲，有目的地改善发酵体系，可以提升大曲的发酵力和增加大曲中风味物质[8]。因此，从高温大曲中分离功能性菌株应用于白酒生产中，对提高白酒的质量和品质具有重要意义。

四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，最早从中药川芎中提取的一类吡嗪类化合物，是治疗心脑血管疾病的有效成分。四甲基吡嗪也是酱香型白酒中重要的风味物质，具有令人愉悦的特殊烤肉和炒坚果香气[9]。白酒中四甲基吡嗪主要由微生物代谢合成，首先经过糖降解途径生成丙酮酸，两分子丙酮酸缩合形成 α-乙酰乳酸，在α-乙酰乳酸脱羧酶的作用下脱羧生成 3-羟基-2-丁酮（又称乙偶姻）；乙偶姻与铵离子通过非酶促反应生成 3-氨基-2-丁酮，随后两分子 3-氨基-2-丁酮脱水缩合生成 2，5-二氢四甲基吡嗪，最后再氧化生成四甲基吡嗪[10−12]。四甲基吡嗪作为酱香型白酒中特征风味物质和功能活性成分，近年来在白酒健康领域受到了广泛关注。

国内很多酒企已经开展产四甲基吡嗪功能菌株的筛选分离、发酵条件优化以及合成途径改造等方法来提高白酒中四甲基吡嗪的含量，进而提升酱香型白酒的品质[13−16]。产四甲基吡嗪的微生物多为芽孢杆菌，尤其以枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为主，但能开发利用的菌株仍然较少。由于芽孢杆菌种类繁多，高温大曲中还有许多目前尚未被发现的微生物具有产四甲基吡嗪的能力。因此，本研究从贵州高温大曲中筛选分离产四甲基吡嗪的微生物，通过菌落形态、显微镜观察和分子生物学方法对其进行鉴定，并对其产酶特性、生长特性及耐受特性等进行研究，为四甲基吡嗪强化高温大曲的制备提供菌株资源。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料 曲样：来源于贵州某酒厂高温大曲。

1.1.2试剂 胰蛋白胨（生化试剂），赛默飞世尔科技公司；酵母提取物（生化试剂），赛默飞世尔科技公司；氯化钠（分析纯），生工生物工程（上海）股份有限公司；芽孢染色液，广东环凯微生物科技有限公司；DNA 提取液（分析纯），奥美嘉生物技术公司；琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒，北京庄盟国际生物基因科技有限公司；无水乙醇（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司；羧甲基纤维素钠（分析纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；可溶性淀粉（分析纯），成都市科隆化学品有限公司；刚果红（分析纯），天津市大茂化学试剂厂。

1.1.3培养基 （1）LB 培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，去离子水 1 L，121℃ 灭菌 20 min。（2）发酵培养基：胰蛋白胨10 g，葡萄糖 5 g，氯化钠 5 g，去离子水 1 L，115℃ 灭菌 20 min。（3）淀粉酶检测培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，可溶性淀粉 5 g，去离子水 1 L，121℃ 高温灭菌 20 min。（4）蛋白酶检测培养基：胰蛋白 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，琼脂粉 15 g，去离子水 1 L，121℃ 高温灭菌 20 min 后，使用前添加 5 mL 无菌脱脂牛奶。（5）纤维素酶检测培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，羧甲基纤维素钠 20 g，去离子水 1 L，121℃ 高温灭菌 20 min。

1.2仪器设备

IS-RDV3 型恒温摇床，苏州捷美电子有限公司；IBI-250T 型生化培养箱，上海施都凯仪器设备有限公司；Veriti 96 型梯度 PCR 仪，赛默飞世尔科技有限公司；Tanon 3500 型凝胶成像仪，上海天能科技有限公司；H1650R 型台式冷冻离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；光学显微镜，广州仪景通光学科技有限公司；UV-8000 型紫外-可见光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1菌株的分离纯化 称取 5 g 高温大曲样品，加入含有 50 mL 无菌生理盐水的三角瓶中，置于摇床振荡 20 min，取上清液按 10 倍梯度稀释至10−3 和 10−4，分别取 0.1 mL 涂布 LB 培养基平板，置于 37℃ 中培养 24 h，观察平板上菌落形态。挑取不同形态的菌落进一步划线纯化后得到纯菌株，培养后用 30% 的甘油重悬菌体于−80℃ 超低温冰箱保藏。

1.3.2产四甲基吡嗪菌株的筛选 四甲基吡嗪的前体物质乙偶姻在碱性条件下被氧化为 2，3-丁二酮，而后与肌酸产生粉红色复合物。通过 V-P 试验对菌株发酵液中乙偶姻进行初步检测，实现对产四甲基吡嗪菌株的初筛[17]。挑取单克隆接种 3 mL LB 培养基中，于 37℃ 摇床过夜培养 12 h。取 500 μL 饱和菌液转接至 50 mL 液体发酵培养基中，以不接种的发酵培养基作为空白对照。在 37℃、200r·min−1 的摇床中培养 24 h，吸取 1.5 mL 发酵液于离心管中，10 000 r·min−1 离心 3 min，取 1 mL 上清液，加入 V-P 试剂振荡混匀，静置 30 min，观察其颜色变化。若反应颜色为红色，表示该菌株具有产四甲基吡嗪的能力。

1.3.3菌株的鉴定

（1）形态学观察

将分离得到的菌株在 LB 培养基平板上划线，在 37℃ 条件下培养 24 h 后观察菌落的颜色、大小和表面特征。将菌株制片，通过芽孢染色进行镜检，在 100 倍显微镜下观察芽孢和细胞的形态特征。

（2）分子生物学鉴定

首先利用基因组 DNA 提取试剂盒来提取菌株的基因组 DNA，并以其为模板，利用引物 27F（ 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增 16S rRNA 基因。PCR 扩增体系（50 μL）：10×缓冲液 5 μL，dNTP 4 μL，引物 27 F 与 1492R各 2 μL，DNA 模板 0.5 μL，DNA 聚合酶 0.5 μL，ddH2O 36 μL。PCR 扩增程序：95℃ 预变性 5 min；95℃ 变性 30 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，循环 30 次；72℃ 再延伸 5 min。利用 1% 琼脂糖凝胶纯化 PCR 产物，割胶回收后送测序公司进行基因测序。测序结果在美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中进行比对分析，选取同源性高的 16S rRNA 基因序列，利用 MEGA7.0 软件以邻接法构建菌株系统发育树。

1.3.4菌株胞外水解酶检测 （1）淀粉酶检测：采用点接法将菌株 FSDQ02 接种到淀粉酶检测培养基平板上，在生化培养箱中 37℃ 培养 24 h 后，用0.5% 碘液进行染色，用去离子水冲洗后，静置 10min，观察菌落周围是否有水解圈的生成。（2）蛋白酶检测：采用点接法将菌株 FSDQ02 接种到蛋白酶检测培养基平板上，在生化培养箱中 37℃ 培养24 h，观察菌落周围是否有水解圈的生成。（3）纤维素酶检测：采用点接法将菌株 FSDQ02 接种到纤维素检测培养基平板上，在生化培养箱中 37℃培养 24 h 后，加入适量的 1% 刚果红染液染色 30min，观察菌落周围是否有水解圈的生成。

1.3.5菌株生长曲线的测定 从培养平板上挑取单菌落接种 3 mL LB 培养基，37℃ 摇床培养 12 h，再按 1% 的接种量转接至 50 mL LB 培养基中，37℃ 摇床培养 12 h 后作为种子液。种子液以 1%接种量接种 50 mL LB 培养基，分别置于 30℃、40℃、50℃，200 r·min−1 摇床培养 36 h，每隔 3 h取样测定菌液吸光度，紫外可见分光光度计波长设置为 600 nm，每个温度条件下 3 个平行，以 LB 培养基作为空白对照。

1.3.6菌株耐受性分析 （1）酸碱耐受性试验：将培养好的种子液以 1% 接种量分别接种 50 mL pH 4、5、6、7、8、9、10 的 LB 培养基中，37℃、200 r·min−1 培养 24 h，通过测定菌液 OD600 值，判断菌株对酸碱的耐受程度。每个 pH 条件下 3 个平行，以 LB 培养基作为空白对照。（2）乙醇耐受性试验：将培养好的种子液以 1% 接种量分别接种于乙醇体积分数为 0、2%、4%、6%、8%、10%、12% 的 LB 培养基中，37℃、200 r·min−1 培养 24h，通过测定菌液 OD600 值，判断菌株对乙醇的耐受程度。每个浓度条件下 3 个平行，以 LB 培养基作为空白对照。（3）NaCl 耐受性试验：将培养好的种子液以 1% 接种量分别接种于 NaCl 质量浓度为 0、 2%、 4%、 6%、 8%、 10%、 12%、 14%、16% 的 LB 液体培养基中，37℃、200 r·min−1 培养24 h，通过测定菌液 OD600 值，判断菌株对盐的耐受程度。每个浓度条件 3 个平行，以 LB 培养基作为空白对照。

2 结果与分析

2.1产四甲基吡嗪芽孢杆菌的筛选

从涂布培养平板上挑取单菌落，接种发酵培养基得到发酵上清液后，加入 V-P 试剂进行颜色观察。与对照相比，其中菌株 FSDQ02 显示红色，V P 反应呈阳性，结果表明筛选得到 1 株产四甲基吡嗪的菌株 FSDQ02（图 1）。

2.2菌株 FSDQ02 的鉴定

2.2.1菌株的形态特征 将菌株 FSDQ02 在平板上划线，得到单菌落。菌落紧贴培养基生长，颜色呈乳白色不透明，表面有褶皱、菌落边缘不规则，内部黏稠不易挑起（图 2A）；通过芽孢染色后镜检观察，菌体呈红色杆状，芽孢呈绿色，与典型的芽孢杆菌特征相符（图 2B）。

2.2.2菌株分子生物学鉴定 根据基因测序结果，将 16S rRNA 基因序列上传到 NCBI 数据库中进行比对，利用软件 MEGA7.0 中的 Neighbor-Joining模型，构建菌株 FSDQ02 系统发育树。由图 3 可知，菌株 FSDQ02 与解淀粉芽孢杆菌聚在同一个分支，亲缘关系较近，相似度在 99% 以上。因此，结合菌株形态特征，初步鉴定 FSDQ02 为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens。

2.3菌株 FSDQ02 的产酶特性

在大曲发酵过程中，微生物代谢过程会产生多种水解酶，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等，其中淀粉酶水解淀粉生成葡萄糖，最终代谢转化为乙偶姻，为四甲基吡嗪的合成提供前体；蛋白酶可以分解蛋白质为氨基酸，为四甲基吡嗪的合成提供氨基[18]。为了测试菌株 FSDQ02 产酶情况，将 FSDQ02 分别点种到蛋白酶检测培养基、淀粉酶检测培养基和纤维素酶检测培养基平板上培养，结果发现 FSDQ02 菌落周围均有明显的水解圈生成，表明 FSDQ02 具有良好产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力（图 4）。因此，菌株 FSDQ02 良好的产酶特性，不仅有利于酿酒原料的利用，对白酒风味物质的形成也起重要作用。

2.4菌株 FSDQ02 的生长温度确定

为了确定菌株 FSDQ02 最适生长温度，在30℃、40℃、50℃ 条件下测试了菌株 FSDQ02 在 LB培养基中的生长曲线。由图 5 可知，在 30～40℃范围内，FSDQ02 生长良好，在 21 h 左右达到平稳期，在 30 h 后进入衰亡期；在 50℃ 时，FSDQ02生长较弱。综上分析，菌株 FSDQ02 在 30～40℃条件下生长良好，其最适生长温度设定为 37℃。

2.5菌株 FSDQ02 的耐受性分析

2.5.1酸碱的耐受性 在白酒发酵过程中，分解淀粉和蛋白质等营养物质会产生有机酸、氨类或其他产物，从而造成酿造环境中 pH 发生变化，这就要求菌株对培养基酸碱变化具有较好的适应能力[19]。由图 6 可知，菌株 FSDQ02 在 pH5.0～9.0 范围内生长良好，对酸碱具有较大的适应范围。

2.5.2乙醇的耐受性 酿酒微生物对乙醇的耐受能力非常重要，因为白酒酿造过程中产生的乙醇会抑制细菌的正常代谢，对其生长繁殖也会造成一定程度的影响[19]。由图 7 可知，随着乙醇浓度的增加，菌株 FSDQ02 的生长速率不断下降，最大耐受乙醇的浓度为 6%，表明菌株 FSDQ02 对乙醇有一定的耐受能力。

2.5.3NaCl 的耐受性 培养基中盐浓度越高，产生的渗透压越大，从而会引起细胞内水活度、细胞结构和酶活性的变化。白酒发酵中高浓度底物引起的高渗透压会导致细胞内水分流失，引起细胞萎缩，影响细胞正常生长[19−20]。因此，筛选菌株对渗透压的耐受能力在白酒酿造中非常重要。由图 8可知，随着 NaCl 浓度的增加，菌株 FSDQ02 生长速率会受到一定程度的抑制，耐受 NaCl 最高浓度为 14%，表明菌株 FSDQ02 对渗透压有一定的耐受性。

3 结论

本研究采用稀释涂布平板法从贵州高温大曲中筛选得到 1 株产四甲基吡嗪的菌株 FSDQ02，通过形态学观察和分子生物学分析初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens。该菌能分泌蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶；在 30～40℃、pH 5～9 的范围内生长良好，同时对 6% 的乙醇和 14% 的 NaCl具有耐受性。综上可知，解淀粉芽孢杆菌 FSDQ02在强化高温大曲和白酒生产中具有较大的应用潜力。

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（责任编辑：柯文辉）