罂粟种质资源遗传多样性和亲缘关系的SRAP分析

摘 要：探明罂粟种质资源遗传多样性和亲缘关系，为罂粟遗传育种研究和种质指纹图谱奠定工作基础。利用形态标记和 SRAP 分子标记两种方法对 25 份罂粟资源的 13 个农艺性状进行测定、分析。结果表明：从 12 对 SRAP 引物中共筛选出 11 对多态性明显、条带清晰的引物组合，对25 份供试材料基因组 DNA 分子进行扩增，共扩增出 210 条谱带，其中多态性条带 81 条，多态性比率为 38.57%。SRAP 聚类分析结果表明：25 份罂粟材料的遗传相似系数在 0.907～0.992，当相似系数在 0.936 处作切割线，可将 25 份供试材料分为 5 个大类和若干亚类。对供试罂粟材料的花色、叶形等农艺性状进行调查分析，当欧式距离为 5.0 时，可将所有罂粟材料可以分为 12 个大类和若干亚类。综上分析表明 25 份罂粟种质资源遗传多样性较丰富，形态标记和 SRAP 分子聚类可以用于研究罂粟种质资源遗传多样性和亲缘关系分析，研究结果可为罂粟遗传育种研究和种质指纹图谱奠定工作基础。

关键词：罂粟；农艺性状；遗传多样性；SRAP 标记

中图分类号：S567.21 文献标志码：A

文章编号：0253−2301（2024）05−0033−06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.05.006SRAP Analysis of the Genetic Diversity and Genetic Relationship of Poppy Germplasm Resources

WANG Yu-hong1，2，3，WANG Xiao1，2，3，ZHANG Zhao-ping1，2，3，WEI Yu-jie1，2，3，SU Yu-jie1，2，3，YANG Zhen-hua1，2，3

（1. Gansu Academy of Agri-Engineering Technology， Lanzhou， Gansu 730000， China; 2. Key Laboratory of the Special Medicine Source Plant for Germplasm Innovation and Safety Utilization， Wuwei， Gansu 733006， China; 3. Hexi Comprehensive Experimental Station of National Traditional Chinese Medicine Industry Technology System， Wuwei，Gansu 733006， China）

Abstract： The genetic diversity and genetic relationship of poppy germplasm resources were explored， which would lay a foundation for genetic breeding research and germplasm fingerprint of poppy. The 13 agronomic traits of 25poppy resources were measured and analyzed by using the two methods of morphological markers and SRAP molecular markers. The results showed that 11 pairs of primer combinations with obvious polymorphism and clear bands were selected from 12 pairs of SRAP primers. The genomic DNA molecules of the 25 tested materials were amplified， and a total of 210 spectrum bands were amplified， of which 81 were polymorphic bands， and the polymorphism rate was 38.57%. The results of SRAP cluster analysis showed that： the genetic similarity coefficient of25 poppy materials was 0.907-0.992. The cutting line was made when the similarity coefficient was 0.936， and the 25tested materials could be divided into 5 categories and several subcategories. The agronomic traits such as flower color and leaf shape of the tested poppy materials were investigated and analyzed. When the euclidean distance was 5.0， all the poppy materials could be divided into 12 categories and several subcategories. In summary， the analysis showed that the genetic diversity of 25 poppy germplasm resources was abundant. The morphological markers and SRAP molecular clustering could be used to study the genetic diversity and genetic relationship of poppy germplasm resources. The results could lay a foundation for the genetic breeding research and germplasm fingerprint of poppy.

Key words： Poppy；Agronomic character；Genetic diversity；SRAP marker

罂粟 Papaver somniferum L.为 1 年生药用草本植物，果实内含罂粟碱、吗啡、海洛因等 30 种生物碱。罂粟具有镇痛、消咳、止泻等重要医疗价值[1]。与此同时，吗啡类生物碱因其成瘾性和依赖性而对社会有极大的危害，国家控制种植，故国内对其相关研究较少。罂粟科植物种类繁多，目前该科在全世界有 38 属约 700 种，广泛分布在全世界温带和亚热带地区[2]。罂粟的花型、颜色及果实与虞美人、鬼罂粟等非常相似，仅从外观上很难鉴别，给公安机关的缉毒取证带来很大困难[3]。对不同生态区的罂粟种质资源进行遗传结构比较研究，有助于揭示遗传变异及其演化的内在原因，并为选育非成瘾性的罂粟品种提供理论依据。

卢龙斗等[4]研究了罂粟属的伪东方罂粟根尖细胞的核型，结果证明该植物体细胞的染色体数目为 2n=42，x=7，具有 6 条中部着丝点染色体，30条近中部着丝点染色体和 6 条近端部着丝点染色体。孙富从等[5]对罂粟属 3 种植物，罂粟、虞美人和伪东方罂粟的染色体核型进行了研究，得出结论：虞美人的核型类型属于 1A 型，罂粟和伪东方罂粟均属于 3A 型。梁倩倩等[6]采用 RT-PCR 对野生罂粟 COR、BBE 基因片段融合及其 RNAi 载体进行了构建，为进一步培育低吗啡高蒂巴因的罂粟种质提供了依据。亢秀萍等[7]为了明确分布在山西省不同地域的野罂粟材料之间的亲缘关系和遗传多样性，以在山西省采集的 6 份野罂粟和采集于内蒙古的 1 份野罂粟引种为研究对象，建立了山西省野罂粟 RAPD 技术扩增体系，分析得知地域分布为野罂粟聚类的主导因素，花色为野罂粟聚类的次要因素。魏玉杰等[8]为揭示不同地区生境条件下的罂粟生态型的染色体核型变化，利用普通压片法对来自中国 5 个省（市）的 10 份罂粟材料染色体与核型进行了分析，发现不同地区来源的罂粟材料可分为白花 1 号和白花 2 号 2 个生态型，染色体均为二倍体，但核型发生了多样性变化。魏玉杰等[9]还利用 ISSR 分子标记对不同生态区罂粟种质进行了多样性研究，发现样品在亲缘关系和地理分布上呈一定的相关性，但没有形成明显的地理变异模式。张爽等[10]从 GenBank 上获得罂粟属植物共 69 条序列，应用 Mega 6.0 软件分析了罂粟属的序列特征，对罂粟属植物核心 DNA条形码进行了筛选。宋炳轲等[11]利用 DNA ITS2条形码序列分毒品原植物大麻、罂粟及其混伪品植物 r DNA 的 ITS2 序列信息，结果表明利用 DNA ITS2 条形码序列有可能鉴定出毒品原植物大麻、罂粟。鉴于前人在罂粟遗传多样性研究未进行过SRAP 分子标记分析。因此，本试验对 25 份罂粟材料进行了 SRAP 标记分析和农艺性状的观察，研究供试罂粟基因组 DNA 的遗传多样性和亲缘关系，为罂粟遗传育种研究和种质指纹图谱奠定工作基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试罂粟材料共 25 份，具体品种名称见表 1。选取各个品种新鲜嫩叶 3～4 片，装入 2.5 mL 离心管，放入液氮罐中带回实验室，并于−80℃ 冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1农艺性状调查 田间试验分别于 2021 年3 月至 2021 年 10 月和 2022 年 3 月至 2022 年 9 月连续两年在甘肃省农业工程技术研究院试验基地进行，每份材料种植 40 株，常规田间管理。在成熟期每个品种选取 10 株典型材料，共调查 13 个性状指标，包括 8 个质量性状（花色、种子颜色、叶形，花瓣形状、茎秆是否有刺、是否为油桃、株高、分枝数）和 5 个数量性状（主果重、主壳重、株果重、株壳重、籽重）等形态学和生物产量性状（表 2）。利用 SPSS 16.0 和 NTSYS-pc 2.1 软件进行分子聚类分析，构建系统聚类图。

1.2.2基因组 DNA 提取 每份材料在四叶期取5 株单株幼嫩叶片提取基因组 DNA。用 1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用蛋白质核酸检测仪检测其浓度和纯度。

1.2.3引物筛选 SRAP 通过独特的双引物设计对基因的 ORFs（Open reading frames 开放阅读框） 的特定区域进行扩增，上游引物长 17 bp，对外显子区域进行特异扩增。下游引物长 18 bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。SRAP 正向和反向引物序列来源于 Li 等[12]﹐由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成。基于前人在多种作物研究中筛选得到的 12 对多态性良好的 SRAP 引物[13−15]，进一步筛选得到 11 对引物。

1.2.4SRAP 分析 利用 SPSS 26.0 软件对罂粟主要农艺性状进行聚类分析。根据电泳图谱进行分析，计算电泳图谱上清晰可靠的扩增产物条带，在相同迁移率位置上有条带记为 1，无条带记为 0，构建二元数据矩阵。采用 NTSYS-pc2.1 软件进行数据分析，利用 Excel 电子数据表计算 25 份罂粟材料的相似系数，采用非加权平均法进行聚类分析，得到罂粟亲缘关系分子聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 主要农艺性状统计分析

对 25 份罂粟种质资源表型性状进行调查、汇总分析。在调查的 8 个质量性状中，花色变异类型较多，有白色、浅粉、粉色、粉紫、浅紫、紫色和红色 7 种颜色。5 个数量性状中，25 份罂粟的籽重为 4.91～27.50 g，其中，BM 最小，AS 最大。株果重为 0～40.87 g，其中，BH1 最小（无分枝，不存在株果），AS 最大。株壳重 0～21.68 g，其中，BH1 最小（无分枝，不存在株壳），CS 最大。

2.2 农艺性状的聚类分析

对形态学聚类图进行分析时，当欧式距离为5.0 时可将 26 份罂粟划分为 12 大类（图 1）。Ｉ类共 6 个，分别为 SE、ON、KE、SS、BH2、NT；均为非油桃材料，花色均为白色，叶形全缘，花瓣为单瓣，种子颜色为米黄色，茎秆无刺。Ⅱ类共5 个，分别为 JY、JS、ZB2、EG，GO；均为非油桃材料，叶形全缘，花瓣为单瓣，茎秆无刺。Ⅲ类 1 个，为 GF。Ⅳ类共 1 个，为 CH。Ⅴ类共4 个，分别为 CE、CN、ZB1，CO；非油桃材料，花色为粉紫色，叶形全缘，花瓣为单瓣，种子颜色为蓝紫色，茎秆无刺。Ⅵ类共 1 个，为 CS。Ⅶ类共 1 个，为 BM。Ⅷ类共 1 个，为 BH1。Ⅸ类共1 个，为 AS。Ⅹ类共 1 个，为 HB。Ⅺ类共 2 个，分别为 ZM、HX；非油桃材料，叶形为全缘，花瓣为单瓣，种子颜色为蓝紫色。Ⅻ类共 1 个，为QZ，非油桃材料，花色为浅紫色，叶形全缘，花瓣为单瓣，种子颜色为蓝紫色。

2.3 SRAP 多态性分析

利用 11 对 SRAP 多态性引物对 25 份罂粟材料进行扩增，共扩增出 210 条条带，其中多态性条带 81 条 ， 多 态 性 比 率 为 38.57%。 引 物 Me7-Em7 扩增出的条带数最多，为 24 条。引物 Me2-Em2 扩增出的条带数最少，为 14 条。多态性最高的引物是 Me6-Em6，多态性比率达 47.82%。引物Me10-Em10 对部分罂粟材料的扩增图谱见图 2。

2.4 遗传相似性分析

根据 SRAP 扩增结果计算各材料间的 SM 相似系数，25 份罂粟材料的相似系数在 0.907～0.992，说明这 25 份罂粟种质资源的遗传关系较近。其中 ON 相似系数最小，为 0.907，表明 ON与其他 24 份罂粟种质资源的亲缘关系相对较远；ZM 和 HX 之间的遗传相似系数最大，为 0.992，表明其亲缘关系密切或基本上没有差异，当为同种异名品种。

2.5 基于 SRAP 分子标记的聚类分析

构建 SRAP 聚类分析树状图（图 3），在相似系数为 0.936 处作切割线 L1，可将 25 份罂粟材料分为 5 大类：Ⅰ类为 SS、BH2、NT 和 KE，材料来源于甘肃酒泉，花色为白色，叶缘为全缘，花瓣形状为单瓣，种子颜色为米黄色。Ⅱ类为 SE 和CH，花瓣形状为单瓣，种子为米黄色材料。Ⅲ类为 CE、CN、CS、CO、ZB1、JY、ZB2、EG、AS、JS 和 BM，非油桃材料，花瓣形状为单瓣。Ⅳ类为 BH1、HB、GF、ZM、HX、QZ 和 GO，花瓣形状为单瓣材料。Ⅴ类为 ON。

在相似系数为 0.964 处作切割线 L2，可将25 份罂粟材料分为 16 个亚类：1 类为 SS 和 BH2，材料均来源于甘肃酒泉，花色均为白色，叶缘为全缘，花瓣形状为单瓣，种子颜色为米黄色。2 类为NT，材料来源于甘肃酒泉，花色为白色，叶缘为全缘，花瓣形232be1a18863e147c9a8b957a90e2c3e状为单瓣，种子颜色为米黄色。3 类为 KE，材料来源于甘肃酒泉，花色均为白色，叶缘为全缘，花瓣形状为单瓣，种子颜色为米黄色材料。4 类为 SE，材料来源于甘肃定西，花色为白色，叶形为全缘，花瓣形状为单瓣，种子为米黄色。5 类为 CH，材料来源于新疆石河子，花色为浅粉色，叶形为裂缘，花瓣形状为单瓣，茎秆有刺，种子为米黄色。6 类为 CE、CN、CS、CO、ZB1，5 份材料均来源于甘肃武威，花色均为粉紫色，叶缘为全缘，花瓣形状为单瓣，种子颜色为蓝紫色材料。7 类为 JY、ZB2 和 EG，材料均为非油桃，花色为浅粉色，叶缘为全缘，花瓣形状为单瓣。8 类为 AS，材料来源于新疆石河子，花色为浅粉色，叶形为全缘，花瓣形状为单瓣，茎秆有刺，种子为蓝紫色。9 类为 JS，材料来源于甘肃武威，花色为浅粉色，叶形为全缘，花瓣形状为单瓣。10 类为 BM，材料来源于青海海东，花色为白色，叶形为全缘，花瓣形状为单瓣，茎秆有刺，种子颜色为米黄色。11 类为 BH1，材料来源于甘肃酒泉，非油桃材料，花色为白色，叶缘为全缘，花瓣形状为单瓣，种子颜色为米黄色。12 类为 HB，材料来源于宁夏石嘴山，花色为白色，叶缘为全缘，花瓣形状为单瓣，油桃，种子颜色为米黄色。13 类为 GF，材料来源于甘肃武威，花色为浅粉色，叶形为全缘，花瓣形状为单瓣。14 类为 ZM、HX 和 QZ，材料来源于青海海东。15 类为 GO，材料来源于甘肃武威，花色为粉色，叶形为全缘，花瓣形状为单瓣。16 类为 ON，材料来源于甘肃定西，非油桃材料，花色为白色，叶缘为全缘，花瓣形状为单瓣，种子颜色为米黄色。

综上分析可以看出，大多数亚类都是由来源地相同且主要形态学性状相同的罂粟材料聚在一起。只有个别来源地不相同的材料聚在一起，但是它们的主要形态学性状相同，可能与外地引种利用有关。由此可以得出罂粟的 SRAP 分类可将与罂粟种质基因型的来源和形态学性状相近的品种较好地聚类。

3 讨论

通过 SRAP 分子标记聚类分析结果表明，来源地相同的供试罂粟材料在分类时基本上聚在一起。比如，第Ⅰ大类包含的 4 个罂粟品种均来自甘肃酒泉以及第Ⅲ大类中来源地相同的材料基本上是相邻的，或者在同一亚类。然而在形态学聚类树状图中并没有体现出来源地相同的材料分在一起的特点。这说明罂粟种质的分子分类与地区分布存在相关性，这种差异是罂粟的地理分布与基因型异交和自然进化有关，使表型趋于相近。在分子聚类的第Ⅱ大类中发现部分形态差异很大的材料，这说明它们 DNA 水平上的相似度较高，可能与异交产生的遗传变异较接近有关。SRAP 聚类与形态学聚类之间有一定的一致性，SRAP 的第Ⅰ大类的 4 个罂粟品种在性状聚类中被分在第Ⅰ类群。罂粟的分子聚类大多数是将来源地和主要形态学性状相同的罂粟材料聚为一类，但是个别来源地不同，但是它们的主要形态学性状相同，可能与引种利用有关。

SRAP 分子聚类分析与罂粟种质的来源，形态学性状有关。而形态学性状的分类比较混乱。研究物种的亲缘关系以及种质资源的多样性对作物育种有重要的指导意义。聚类分析是一种非常好的研究植物亲缘关系和分类的生物数学方法，可以帮助探明种内变种间的遗传多样性，为罂粟通过选择育种、种内杂交、杂种优势利用等手段培育价值更高的优良品种提供了很好的参考。利用植物学形态特征来确定植物种内变种或品种之间的亲缘关系这一传统方法具有一定的合理性，但此方法所凭借的形态特征仍受到环境因子和个体发育的影响，不能提供足够的能反映内在基因型遗传关系的信息。分子标记所代表的是基因组 DNA 水平上的差异，不受外界环境及作物生长发育阶段的影响，利用分子标记研究作物的亲缘关系及多样性，其结果具有客观、稳定的特点。本研究结果表明，对罂粟的种质资源遗传多样性和亲缘关系的分析，SRAP 分子标记优于形态学性状分析。

4 结论

本研究分别从形态学和 SRAP 分子标记方面对 25 份罂粟种质资源进行了遗传多样性评价及其亲缘关系的探讨。利用 SRAP 标记在相似系数为0.936 处将 25 份罂粟种质资源分为 5 大类和若干亚类，在相似系数为 0.964 处将其分为 16 个大类和若干亚种，体现了 SRAP 分子聚类分析与罂粟种质的来源，形态学性状有关。利用农艺性状系统聚类在欧式距离为 5.0 处将 25 份罂粟材料划分为 12 大类和若干亚类，欧式距离为 2.0 处将其分为 23 大类和若干亚类，分类比较混乱。因此，对罂粟的种质资源遗传多样性和亲缘关系的分析，SRAP 分子标记优于形态学性状分析。本研究通过对罂粟种质资源遗传多样性和亲缘关系的研究，可为罂粟种质资源的合理开发利用及罂粟优势亲本选配提供科学依据。此外，SRAP 分子标记技术的成功应用，可为今后进一步开展罂粟遗传育种研究和种质指纹图谱深入研究奠定基础。

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（责任编辑：林玲娜）