GeneXpert MTB/RIF联合外周血细胞分析用于肺结核临床诊断的效果

【摘要】 目的：观察结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（GeneXpert MTB/RIF）联合外周血细胞分析用于痰涂片阴性可疑肺结核（TB）临床诊断的效果。方法：选取吉安市第一人民医院2022年10月—2023年9月收治的66例痰涂片阴性可疑TB患者。所有患者接受GeneXpert MTB/RIF检测及外周血细胞分析检测，对CD45+CD3+、CD4+CD45+及CD163+进行分析，患者均经痰培养及菌种鉴定是否为肺结核。分析GeneXpert MTB/RIF检测及外周血细胞分析诊断痰涂片阴性可疑TB的价值。结果：66例患者中，36例可疑肺结核经痰培养、菌种鉴定确诊为TB患者（TB组），30例患者为非TB者（非TB组）。GeneXpert MTB/RIF检出30例阳性患者，检出率为83.33%。TB组CD45+CD3+低于非TB组，CD4+CD45+及CD163+高于非TB组，差异均有统计学意义（P<0.05）。受试者操作特征（ROC）曲线分析结果显示，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+联合GeneXpert MTB/RIF诊断痰涂片阴性TB的曲线下面积（AUC）高于单独检测，差异均有统计学意义（P<0.05）。GeneXpert MTB/RIF联合外周血细胞分析（CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+）的敏感度为92.87%。结论：GeneXpert MTB/RIF检测及外周血细胞分析联合诊断痰涂片阴性可疑TB的价值显著，检出率较高。

【关键词】 核酸扩增体系检测 肺结核 血细胞分析 诊断 痰涂片

Effect of GeneXpert MTB/RIF Combined with Peripheral Blood Cell Analysis for the Clinical Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis/GUO Douhua， YIN Yingying， LI Yue. //Medical Innovation of China， 2024， 21（19）： -147

[Abstract] Objective： To observe the effect of Mycobacterium tuberculosis/Rifampicin resistance real-time fluorescence quantitative nucleic acid amplification detection （GeneXpert MTB/RIF） combined with peripheral blood cell analysis for the clinical diagnosis of suspected pulmonary tuberculosis （TB） with sputum smear negative. Method： A total of 66 sputum smear negative suspected TB patients admitted to Ji’an First People's Hospital from October 2022 to September 2023 were selected. All patients underwent GeneXpert MTB/RIF test and peripheral blood cell analysis for CD45+CD3+， CD4+CD45+ and CD163+， and patients were identified by sputum culture and strain indentification for tuberculosis. The value of GeneXpert MTB/RIF test and peripheral blood cell analysis for diagnosing sputum smear negative suspected TB was analyzed. Result： Among 66 patients， 36 patients with suspected pulmonary tuberculosis were diagnosed as TB patients （TB group） by sputum culture and strain identification， and 30 patients were non-TB patients （non-TB group）. GeneXpert MTB/RIF was detected in 30 positive patients， with a detection rate of 83.33%. The CD45+CD3+ of TB group was lower than that of non-TB group， CD4+CD45+ and CD163+ were higher than those of non-TB group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The results of receiver operating characteristic （ROC） curve analysis showed that the area under the curve （AUC） of the combination of CD4+CD45+， CD45+CD3+， CD163+ and GeneXpert MTB/RIF detection was higher than that of single detection， the difference was statistically significant （P<0.05）. The sensitivity of GeneXpert MTB/RIF combined with peripheral blood cell analysis （CD4+CD45+， CD45+CD3+ and CD163+） was 92.87%. Conclusion： GeneXpert MTB/RIF detection and peripheral blood cell analysis combined with sputum smear negative suspected TB has significant value and high detection rate.

[Key words] Nucleic acid amplification detection Tuberculosis Blood cell analysis Diagnosis Sputum smear

First-author's address： Department of Clinical Laboratory， Ji’an First People's Hospital， Ji’an 343000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.19.033

肺结核（TB）是结核分枝杆菌（MTB）感染所致的慢性传染性呼吸道疾病。全球结核病流行病学调查资料显示，2017年全球有1 000万新发结核病患者，其中中国占据9%，每年死于结核病的人数约为其他寄生虫病及传染病总和的2倍[1]。传统的结核病实验室诊断方式包括痰涂片镜检、比例法药敏试验及罗氏固体培养法等，敏感度较低且需要较长时间，无法及时为临床提供有价值的参考依据[2-4]。随着分子生物学技术的快速发展，在2010年世界卫生组织推荐核酸检测作为TB诊断的创新技术，目前已在较多研究中应用[5]。美国在荧光定量检测的基础上率先开发了结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（GeneXpert MTB/RIF），它能在2 h内完成检测，且检出率高[6]。GeneXpert MTB/RIF操作简单快速、对实验条件要求低，世界卫生组织于2011年批准该检测用于诊断结核病[7]。但目前对于痰涂片阴性TB，GeneXpert MTB/RIF诊断价值尚不清楚。近年来，外周血细胞分析逐渐被用于诊断TB[8]，但临床报道比较少，其对于于痰涂片阴性TB诊断价值不明，本研究主要分析GeneXpert MTB/RIF联合外周血细胞分析用于痰涂片阴性TB临床诊断的效果，为临床诊断TB提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取吉安市第一人民医院2022年10月—2023年9月收治的66例痰涂片阴性可疑TB患者。所有患者接受GeneXpert MTB/RIF及外周血细胞分析检测；临床诊断标准：具有肺结核可疑症状且有密切接触史；痰涂片阴性[9]。（1）纳入标准：痰涂片阴性疑似TB；临床资料完整；年龄≥18岁；均经痰培养及菌种鉴定是否为肺结核。（2）排除标准：妊娠期或哺乳期；恶性肿瘤；免疫系统疾病；无法配合完成本研究；合并其他呼吸系统疾病；合并其他可能影响免疫功能的疾病。患者及患者家属均知情本研究且签署研究同意书。本研究获得吉安市第一人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 痰培养及菌种鉴定 所有患者均进行痰培养及菌种鉴定确诊TB：治疗前采集清晨痰、夜间痰和即时痰标本，用无菌生理盐水反复漱口2或3次后，取深部痰液咳出液并弃掉第1次痰液，取1或2口，将3次痰标本混合后留置无菌盒，30～60 min内立即送检，取2 mL痰标本离心，随后取0.5 mL沉淀物放置于MGIT培养管内，于37 ℃培养箱内进行培养；第2天起观察MTB的生长情况，采用手工读数仪读取结果，阴性培养管继续培养和读管6周。菌种鉴定：通过硝基苯甲酸（PNB）生长实验、耐热触酶实验、28 ℃生长实验、菌落颜色、细菌的生长速度等实验鉴定。若PNB（+）、耐热触酶（+）、28 ℃（+）、菌落颜色有或无、生长速度为≤28 d，则为非结核分枝杆菌；若PNB（-）、耐热触酶（-）、28 ℃（-）、菌落颜色无、生长速度为>28 d，则为结核分枝杆菌。

1.2.2 GeneXpert MTB/RIF检测 将痰取样同时进行GeneXpert MTB/RIF检测，全自动GeneXpert仪器及试剂盒均购自广州达安公司，严格按照试剂盒说明书，取痰标本进行检测，2 h后读取结果。当内对探针的循环阈值≤40时判断为阳性，若≥3个探针的循环阈值≤40为检测出MTB。结核分枝杆菌的检测结果分为未检出、极低、低、中、高5个等级[10]。

1.2.3 外周血细胞分析检测 采集清晨空腹静脉抗凝血4 mL，加入混合抗体（CD45、CD3、CD163、CD4，购自深圳唯公生物有限公司），加入红细胞裂解液2 mL，离心以2 000 r/min速度，离心5 min，离心半径15 cm，去上清后加入磷酸盐缓冲液2 mL，后采用流式细胞仪（厂家：美国BD公司，型号，BD-accuri-C6）对CD45+CD3+、CD4+CD45+进行分析，采用酶联免疫吸附法对CD163+进行分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；定性资料用率（%）表示，组间比较采用字2检验；受试者操作特征（ROC）曲线下面积（AUC）之间比较采用Z检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰培养及菌种鉴定结果

66例患者中，36例可疑TB经痰培养、菌种鉴定确诊为TB患者（TB组），30例患者为非TB患者（非TB组）。

2.2 TB组与非TB组基线资料比较

非TB组30例中男15例，女15例；年龄28～86岁，平均（49.76±8.12）岁；平均体重指数（22.35±1.02）kg/m2。TB组36例中男17例，女19例；年龄28～85岁，平均（50.23±8.02）岁；平均体重指数（22.34±1.10）kg/m2。两组性别、年龄及体重指数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.3 GeneXpert MTB/RIF检出情况

36例痰涂片阴性TB患者，GeneXpert MTB/RIF检出30例阳性患者，检出率为83.33%。

2.4 外周血细胞分析情况

TB组CD45+CD3+低于非TB组，CD4+CD45+及CD163+均高于非TB组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.5 GeneXpert MTB/RIF联合外周血细胞分析结果诊断TB的效能

ROC分析结果显示，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+联合GeneXpert MTB/RIF诊断痰涂片阴性TB的AUC高于单独检测，差异均有统计学意义（P<0.05）。GeneXpert MTB/RIF联合外周血细胞分析（CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+）的敏感度为92.87%。见图1、表2。

3 讨论

TB是由一类独立于麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌外的MTB复合群引起，广泛分布于水源、灰尘等自然环境中，可诱发人体肺、中枢神经、皮肤等组织或器官感染，尤以肺部感染症状显著，可导致患者出现胸闷、咯血等严重呼吸道症状，危及患者的生命安全[10-12]。随着医疗科技的不断进步与完善，TB感染的检出率逐年升高，但临床诊疗中仍存在较高的误诊、漏诊率[13]。既往研究证实，Xpert MTB/RIF检测法应用于痰涂片阴性结核病的诊断价值较高[14]。本研究发现，36例TB患者中，GeneXpert MTB/RIF检出30例阳性患者，检出率为83.33%，提示GeneXpert MTB/RIF检出TB的价值较高，符合既往研究[11]。

CD45+CD3+是指在免疫细胞表面上同时表达CD45和CD3的一类淋巴细胞。CD45是一种常见的白细胞抗原，CD3则是T细胞受体复合物的一部分，主要存在于成熟的T细胞表面。在肺结核的情况下，免疫细胞可能会发生变化，包括T细胞的活化和增殖[15-16]。CD45+CD3+细胞的增多可能反映了机体对MTB的免疫应答，在结核病的发病过程中，T细胞参与了由宿主的细胞因子介导的免疫应答，这也是肺结核病理过程中的一个重要方面，因此，CD45+CD3+细胞可以反应肺结核患者免疫状态[8]。CD4+CD45+T细胞属于调节性T细胞，CD45存在于所有有核造血细胞中，而CD4是辅助性T细胞表面的一种共受体蛋白[17]。CD4+T细胞是一种在适应性免疫应答中起关键作用的免疫细胞[18]。它们通过分泌细胞因子和激活其他免疫细胞来帮助协调和调节免疫反应，当患者被MTB感染后，CD4+CD45+细胞的数量和活性也会发生相应改变[19]。CD163是一种Ⅰ型膜蛋白受体，主要表达于单核细胞和M2型巨噬细胞[20]。它参与多种免疫功能，包括调节炎症和清除细胞碎片，也是巨噬细胞的标志物，巨噬细胞在组织修复和重塑中起着至关重要的作用，与多种疾病有关，包括癌症、自身免疫性疾病和传染病[21]。在研究和诊断环境中，CD163常被用作识别和研究巨噬细胞的特异性标志物。随着入侵时间变长，结核杆菌会通过一系列的策略干扰巨噬细胞向M1型转变，以获得巨噬细胞的免疫逃逸，肺结核患者体内M2型巨噬细胞数量增多，与此同时，CD163+的表达数量和活性也会发生变化，通过外周细胞血对CD163的检测结果，可以判断患者被MTB的感染状况。本研究结果显示：TB组CD45+CD3+低于非TB组，CD4+CD45+及CD163+均高于非TB组。ROC分析结果显示，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+联合GeneXpert MTB/RIF诊断痰涂片阴性TB的AUC高于单独检测，提示联合检测检出痰涂片阴性TB的价值高，CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+单独检测只是免疫细胞表面标志物的一种表达情况。

需要注意的是，单凭血细胞分析的检测结果不能作为肺结核的确诊依据，通过GeneXpert MTB/RIF联合外周血细胞分析（CD4+CD45+、CD45+CD3+及CD163+），对痰涂片阴性TB敏感度为92.87%，提示GeneXpert MTB/RIF检测及外周血细胞分析联合诊断痰涂片阴性可疑TB的价值显著，而综合上述指标可全面评估感染肺结核后免疫状态的改变，值得在临床上推广使用。GeneXpert MTB/RIF法操作快捷简便，出结果只需2 h左右，且试剂盒独立储存，受细菌污染的风险较小[22]。从生物安全角度来看，GeneXpert MTB/RIF是一种基于核酸检测的方法，使用该法检测标本对于实验室生物安全防护的要求也与其他检测方法的要求相当[20]，该方法的结核检出率高，能够更快地检测出结核病原体。

综上所述，GeneXpert MTB/RIF检测及外周血细胞分析联合诊断痰涂片阴性可疑TB的价值显著，检出率较高。

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（收稿日期：2024-01-09） （本文编辑：白雅茹）