脱细胞技术在构建人工卵巢中的应用进展

[摘要]人工卵巢是天然卵巢的临时替代品，是将分离的卵泡、卵巢基质细胞和生长因子组合并包裹到生物材料中而形成的卵巢类器官。人工卵巢可恢复患者的生育功能和部分分泌功能，其中构建适合卵泡生长的生物支架材料是人工卵巢的核心。脱细胞基质材料是通过物理、化学、生物酶或其他方法有效去除组织中的细胞及核物质，以获得细胞外基质。这种细胞外基质因去除了组织中的细胞和核物质，表现为低免疫原性；同时最大程度地保留了卵巢的组织结构和功能性基质蛋白，从而有效促进细胞的黏附、增殖和分化。脱细胞基质材料被认为是目前最理想的卵巢生物支架材料。本文对脱细胞技术在构建人工卵巢中的应用进展进行综述，以更好地理解其机制和优缺点，为进一步优化脱细胞技术在人工卵巢构建中的应用提供新思路。

[关键词]人工卵巢；脱细胞技术；细胞外基质

[中图分类号]R711[文献标识码]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.18.032

近年来，全球肿瘤发病率逐年升高，且呈年轻化趋势。放化疗是恶性肿瘤治疗中不可缺少的部分，而放化疗会不可避免地产生不良反应，如骨髓抑制和生殖毒性等。生殖毒性可导致绝大多数女性患者在接受放化疗后出现卵巢早衰甚至生育功能丧失[1-2]。因此，这些患者保留生育能力的需求较为迫切。

人工卵巢是天然卵巢的临时替代品[3]。人工卵巢在恢复患者生育功能的同时还能恢复患者的部分分泌功能。人工卵巢已成为近年来生育力保护研究的热点，其中寻找适合卵巢细胞的生物支架材料是构建人工卵巢的核心。脱细胞基质材料是通过脱细胞技术有效去除组织或器官内的细胞和核物质，从而保留原有的组织结构和功能性基质蛋白，可有效促进细胞的黏附、增殖和分化，被认为是当前最理想的卵巢生物支架材料[4]。脱细胞技术主要是通过物理、化学、生物酶或多种方法联合达到去除器官或组织内细胞及核物质的目的[5]。脱细胞基质材料的制备见图1。对于卵巢脱细胞方案而言，目前还没有标准的脱细胞方案，只有一组评价去除细胞效果的标准：①每毫克细胞外基质干重的双链DNA含量<50ng；②DNA片段长度<200bp；③4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色无明显核物质存在[6]。

1脱细胞化学试剂

1.1表面活性剂

表面活性剂是通过破坏磷脂细胞膜达到细胞溶解的目的。表面活性剂包括离子型（呈现正电荷或负电荷）、非离子型（含有不带电荷的亲水性基团）及两性型（兼具离子型及非离子型表面活性剂特征）。

1.1.1十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠是目前使用最广泛的离子型表面活性剂，其可快速、彻底地去除器官或组织内的细胞及核物质；但具有一定的细胞毒性，对组织蛋白也有一定的损伤，甚至会改变组织的微观结构[7-8]。受十二烷基硫酸钠的细胞毒性影响，所有用到这类试剂的脱细胞方案都需执行严格的洗涤方案，尽可能地去除残留在材料中的化学试剂[9]。

1.1.2TritonX-100TritonX-100是一种非离子表面活性剂。TritonX-100对组织结构的影响较小，可较好地保存组织的完整性，但其对细胞外基质中的糖胺聚糖影响较大，在脱细胞过程中会造成糖胺聚糖的丢失，且单独使用达不到组织和器官的脱细胞标准[10]。基于这种情况，这类试剂通常是作为辅助脱细胞试剂，与其他试剂联合使用，从而达到减少其他化学试剂的浓度和作用时间的目的。

1.1.3CHAPSCHAPS是一种两性表面活性剂，兼具离子型及非离子型表面活性剂的特征。CHAPS的优点是对基质中的蛋白无影响，包括胶原蛋白、弹性蛋白及纤维蛋白，更有利于保持基质的微观结构；其缺点是会降低细胞外基质的机械性能。CHAPS对于较薄组织的脱细胞效果理想，但对于较厚组织的单独使用则无法达到有效脱细胞的标准[11]。

1.2酸和碱

酸碱具有强腐蚀性和强氧化性。其脱细胞原理主要通过酸碱使组织蛋白变性，让细胞内核酸受到破坏，进而使细胞膜和核物质增溶，从而达到破坏细胞的目的。酸碱对组织蛋白的破坏是对所有蛋白无差别的破坏，包括机体所需要的基质蛋白；同时，酸碱也会改变细胞外基质的机械性能。

1.2.1过氧乙酸过氧乙酸是一种易溶于水的弱酸，具有强腐蚀性和强氧化性。在猪膀胱源性细胞外基质的胶原纤维排列及双向力学行为研究中发现，经过氧乙酸消毒处理的膀胱基质的胶原排列分布发生较大变化，进而影响基质的机械性能[12]。同时，对基质中的蛋白也有一定的影响，包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白、糖胺聚糖及一些信号蛋白[13]。

1.2.2氢氧化钙、硫化钠和氢氧化钠氢氧化钙、硫化钠和氢氧化钠等都易溶于水，其均是具有强腐蚀性和强氧化性的强碱性溶液。在早期脱细胞实验中，主要用于去除样本中的毛发[14]。Eivazkhani等[15]通过比较不同化学试剂（十二烷基硫酸钠、氢氧化钠）对卵巢组织的影响，发现氢氧化钠比十二烷基硫酸钠更适合卵巢组织脱细胞，在后期支持卵泡重建中表现出更好的效果。

2生物学方法

2.1生物酶

生物酶通过作用于特定蛋白破坏细胞及核物质，主要用于脱细胞方案的进一步优化，脱细胞效果与组织细胞外基质的结构特征及蛋白成分有很大的相关性。其优点是可选择性地去除组织中的细胞及核物质；缺点是生物酶长时间的作用会对基质中的胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等天然基质成分造成一定的损害[16]。鉴于生物酶长时间的使用会对基质蛋白造成破坏，在脱细胞处理时生物酶的使用需要严格把控作用时间。

2.2核酸酶

核酸酶一种作用于核苷酸链中磷酸二酯键的水解酶，通过水解核苷酸之间的磷酸二酯键，将DNA或RNA裂解成多个片段，从而有效去除组织内的核物质。但核酸酶只针对核物质，一般同其他脱细胞试剂联合使用，目的是强化去除核物质。研究发现，核酸酶同脱氧胆酸钠联合应用可极大提高组织DNA的去除率[17-18]。

3物理方法

物理方法是利用物理原理裂解细胞并破坏细胞基质黏附蛋白，从而实现组织内细胞有效去除的方法。

3.1高渗、低渗溶液

高渗和低渗溶液脱细胞的机制主要是通过渗透休克破坏细胞的细胞膜结构并形成细胞碎片，同时也可干扰DNA与蛋白质之间的相互作用。然而，这种方式可对组织内细胞进行有效破坏，但细胞破坏后形成的大量细胞碎片及核物质却残留在组织内，无法有效从基质内移除[19]。因此，这种方式单独使用时的脱细胞效果欠佳，通常需同其他方法联合使用。

3.2冻融循环

冻融循环通常是指在-80℃和37℃之间反复进行冷冻-解冻交替循环，在冻融过程中组织或器官内细胞不断形成冰晶，破坏细胞膜，从而实现细胞的破坏[20]。在具体的脱细胞方案中，可通过改变温度差或改变冻融的次数寻找最合适的冻融温度和冻融次数。甚至有文献报道可将冻融循环持续整个脱细胞过程，得到的细胞外基质并不会因为冻融循环次数的增加而增加蛋白的丢失[21]。但单独的冻融循环无法有效去除组织内残留的核物质，需同其他方法联合使用才能达到较好的脱细胞效果。

3.3高静水压

高静水压是指对组织或器官施加600MPa以上的压力，通过高强度压力破坏组织或器官细胞[6]。高静水压脱细胞时，较高的静水压破坏细胞的效果较好，但同时也会引起基质蛋白的变形，从而影响基质的机械性能。因此，高静水压的水压必须控制在一定压力之下，以确保不引起基质蛋白的机械性能改变。

3.4超临界二氧化碳

超临界流体具有似液体的密度及似气体的扩散系数，其临界温度为31.1℃，临界压力为7.40MPa，与生物体系相容。超临界流体的优点是可在类似于临界点受控速度通过组织时，将组织中的细胞移除，可将组织的机械性能的破坏降到最低[22]。此外，二氧化碳是一种具有扩散性的气体，不会残留在组织内，因此不需要洗涤过程。然而，超临界二氧化碳是非极性的，在对细胞膜等极性物质进行溶解时，需要添加极性夹带剂（如乙醇），但添加这种新的夹带剂会给组织引入新的杂质[23]。对于超临界流体，目前已应用于多个脏器及组织的脱细胞处理中，并取得良好效果。在大鼠心脏组织、猪角膜、猪和牛心包及人类脂肪组织等方面，都已有明确报道成功应用超临界流体方法对组织进行有效脱细胞的案列，同时保留了组织的结构和机械性能[24-27]。

3.5温度

温度主要是通过影响其他脱细胞试剂、酶及蛋白的活性间接影响脱细胞效果。不同温度可能会导致蛋白含量和结构发生变化。Hashimoto等[28]在对角膜进行脱细胞研究中发现，角膜在不同温度条件下脱细胞得到的脱细胞基质中的胶原和糖胺聚糖含量存在差异，10℃比30℃的保存效果更好。

4程序性细胞死亡

程序性细胞死亡是通过传送合适的信号，有意激活细胞凋亡路径。整个程序性死亡只是以组织内的细胞为目标，从而使组织内的细胞外基质得以完整保留[29]。与传统的脱细胞方式不同，在程序性细胞死亡过程中，细胞没有被破坏，而核物质是被包裹在细胞膜或凋亡小体内的[30]。因此，材料具有免疫原性的细胞成分或核物质成分均不会向基质中泄露，从而有效降低材料免疫排斥的发生[31-32]。通过诱导细胞凋亡得到的脱细胞细胞外基质还有一个潜在的优势，即通过刺激邻近祖细胞的增殖参与组织再生[33]。

5小结与展望

人工器官是近几年的研究热点，其可有效解决移植器官来源紧缺的问题，同时可有效减少因器官移植后长期免疫抑制治疗对患者生活质量的影响，在骨骼、血管、皮肤等领域获得了很好的效果。

人工卵巢领域的研究起步相对较晚，2015年Laronda等[34]才首次将脱细胞技术应用于构建卵巢生物支架材料。通过众多研究者的不断探索，卵巢脱细胞技术已取得很大进展，已先后获得鼠、猪、牛和人等卵巢组织脱细胞基质。但就目前的卵巢脱细胞技术而言，仍存在诸多问题。如脱细胞基质内核物质残留、脱细胞过程对基质的改变（包括基质功能蛋白的损伤、生物力学性能的改变以及细胞毒性作用）等。同时，人工卵巢也引发了一些伦理问题，如卵巢组织来源及捐赠者的知情同意和隐私保护，关于个人遗传信息保护和隐私保护，人工卵巢使用对象的公平和公正等伦理问题。希望通过对人工卵巢这项新的医疗治疗手段进行各方利益和权益的权衡，采取一系列措施确保其使用的安全、合法及符合伦理要求。相信在不久的将来，随着研究者对各个环节关键技术的突破，将人工卵巢应用到临床中并为卵巢衰竭患者提供新的治疗方案。

利益冲突：作者声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2023–08–07）

（修回日期：2024–06–08）