稽留流产患者绒毛组织miR-19b与PTEN的表达及临床意义

徐丹 谢君 刘佳 龚洁 彭宇婷 唐芳 邹顺 薛青

摘要：目的  检测稽留流产患者绒毛组织miR-19b与PTEN的表达水平并分析其临床意义。方法  选取2022年1月-5月在本院诊断治疗的稽留流产患者30例作为试验组，同期选取30例正常早孕并要求终止妊娠妇女为对照组，比较两组绒毛组织中miR-19b、PTEN的表达水平及相关性。结果  试验组miR-19b相对表达量（1.792±0.905）高于对照组（0.538±0.443），PTEN mRNA相对表达量（1.909±1.099）低于对照组（6.316±2.597），PTEN蛋白相对表达量（0.036±0.016）低于对照组（0.084±0.013）（P<0.05）。相关性分析显示，对照组绒毛组织中miR-19b与PTEN的表达呈负相关（r=-0.584，P=0.001）。结论  稽留流产患者绒毛组织miR-19b表达升高，可能通过调控PTEN影响滋养细胞的增殖、凋亡及侵袭。

关键词：稽留流产；绒毛组织；miR-19b；PTEN

中图分类号：R714.21                                文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.12.018

文章编号：1006-1959（2024）12-0085-04

Expression and Clinical Significance of miR-19b and PTEN in Villus Tissue of Patients

with Missed Abortion

Abstract：Objective  To detect the expression levels of miR-19 b and PTEN in villus tissues of patients with missed abortion and analyze their clinical significance.Methods  A total of 30 patients with missed abortion diagnosed and treated in our hospital from January to May 2022 were selected as the experimental group， and 30 normal early pregnant women who required termination of pregnancy were selected as the control group. The expression levels and correlation of miR-19b and PTEN in villus tissues of the two groups were compared.Results  The relative expression of miR-19b was （1.792±0.905） in the experimental group， which was higher than（0.538±0.443）in the control group; the relative expression of PTEN mRNA was （1.909±1.099） in the experimental group， which was lower than （6.316±2.597） in the control group; and the relative expression of PTEN protein was （0.036±0.016） in the experimental group， which was lower than （0.084±0.013） in the control group（P<0.05）. Correlation analysis showed that there was a negative correlation between the expression of miR-19b and PTEN in villus tissues of control group （r=-0.584， P=0.001）.Conclusion  The expression of miR-19b in villus tissue of patients with missed abortion is increased， which may affect the proliferation， apoptosis and invasion of trophoblast cells by regulating PTEN.

Key words：Missed abortion;Villous tissue;miR-19b;PTEN

稽留流产是一种特殊类型的自然流产，发生在妊娠12周之前为早期自然流产。该病发生的原因众多，包括染色体异常、生殖道畸形、内分泌失调、感染因素、血栓前状态、自身免疫因素等，但发病者中仍有半数以上原因未明。微小RNA（microRNA， miRNA）是由21～24个核苷酸组成的内源性非编码小RNA，与mRNA的3'非翻译区（3'UTR）结合，通过诱导目标mRNA的降解介导转录调节[1]。研究表明[2，3]，miRNA参与多种细胞生物学活动，如细胞分化、增殖、迁徙、侵袭和凋亡，其异常表达与流产密切相关。已有研究表明[4]，不明原因复发性流产（URSA）患者胎盘组织中可检测到多种与正常患者差异表达的miRNA，其中一些miRNA已被证明能够通过参与靶基因的调控来影响URSA的发生及发展。目前研究miRNA在复发性流产中的作用主要包括促进滋养细胞凋亡，抑制增殖；改变免疫因素；通过单核苷酸多肽性（SNPs）或单倍体以及调控血管内皮，增加流产的易感性，促进机体对胚胎的吸收，进而参与流产的发生发展。PTEN是一种抑癌基因，参与调节多种细胞的凋亡，PTEN可通过PI3K/AKT信号通过在细胞周期、生长、迁移和凋亡中发挥重要作用[5]。既往的报道显示，PTEN基因在各种肿瘤组织中表达缺失或突变[6]，并且在正常胎盘组织、子宫内膜和蜕膜中也有表达[7]。一些研究表明[8]，PTEN在胚胎发育过程中可能是必不可少的，改变PTEN的表达可能与自然流产有关。本研究通过分析稽留流产患者绒毛组织miR-19b与PTEN的表达及其相关性，探讨miR-19b可能通过PTEN参与滋养细胞增殖、凋亡过程，探寻自然流产的病因机制，旨在为自然流产的治疗提供更多思路。

1资料与方法

1.1一般资料  选取2022年1月-5月在岳阳市人民医院接受治疗的稽留流产患者30例纳入试验组，符合早期妊娠稽留流产诊断标准，患者年龄22～35岁，平均年龄（28.53±3.51）岁；停经6～11周，平均停经时间（8.00±1.20）周；孕次1～5次，平均孕次（2.23±1.19）次；产次0～3次，平均产次（0.57±0.77）次；体重指数（BMI）18.4～26.8kg/m2，平均BMI（22.06±2.56）kg/m2。另同期选取30例正常早孕并要求终止妊娠妇女为对照组，对照组所有对象经临床检查显示为正常宫内早孕，且宫内胚胎发育正常。年龄22～34岁，平均年龄（28.67±3.28）岁；停经6～11周，平均停经时间（8.07±1.17）周；孕次1～6次，平均孕次（2.37±1.47）次；产次0～2次，平均产次（0.53±0.63）次；BMI 17.6～26.4kg/m2，平均BMI（21.39±2.52）kg/m2。两组年龄、孕周、孕次、产次及BMI比较，差异无统计学意义（P>0.05），可比较。两组研究对象在标本获取前均无激素类药物服用史，无染色体异常，无生殖道畸形，无生殖器感染性疾病，无自身免疫性疾病，无内分泌异常，无内外科合并症，无有害物质接触史，无吸烟、酗酒、吸毒等不良生活习惯。本研究并经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2人绒毛组织的收集及处理  所有患者均行米非司酮+米索前列醇药物流产，妊娠组织物排出后，采集绒毛组织标本，在生理盐水中反复漂洗至无血色，每个样本被分为3管，2管在液氮中保存24 h 后移至-80 ℃冰箱保存用于实时荧光定量PCR（qPCR）实验，1管在4%多聚甲醛中固定24 h后实施常规脱水处理，石蜡包埋切片。

1.3实验方法

1.3.1 qPCR检测  miR-19b和PTEN表达  Trizol法（美国Thermo）提取绒毛组织中总RNA后测RNA的浓度及纯度，按照中国北京康为世纪公司试剂盒（CW2569，CW2141）说明进行逆转录反应，以GAPDH作为内参，用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。

1.3.2免疫组织化学法（Immunohistochemical， IHC）检测PTEN的表达  将石蜡标本切片后二甲苯脱蜡、100%到75%乙醇梯度水化，于高压枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中进行抗原修复。用1%高碘酸灭活内源性酶，滴加适当稀释的一抗（PTEN），4 ℃过夜，再滴加50～100 μl抗-兔-IgG抗体-HRP多聚体37 ℃孵育30 min。再使用DAB溶液显色，经过苏木精复染、脱水、透明和封片等处理后显微镜下观察PTEN的染色情况。结果判定：细胞质或细胞核中有棕黄色颗粒沉着为PTEN蛋白阳性表达。高倍镜下按随机数字表法选取5个400倍视野，采用Image-Pro plus 6.0分析平均光密度（average optical density， AOD）值。

1.4统计学方法  采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；采用Pearson相关分析统计数据相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组绒毛组织内miR-19b的表达比较  qPCR检测结果显示，试验组绒毛组织miR-19b相对表达量为（1.792±0.905），高于对照组的（0.538±0.443），差异有统计学意义（t=6.816，P=0.000），见图1。

2.2两组绒毛组织内PTEN mRNA的表达比较  qPCR检测结果显示，试验组绒毛组织PTEN mRNA相对表达量为（1.909±1.099），低于对照组的（6.316±2.597），差异有统计学意义（t=-8.559，P=0.000），见图2。

2.3两组绒毛组织内PTEN蛋白的表达比较  免疫组化显示，PTEN在稽留流产滋养细胞胞质中少量表达，呈浅棕黄色，绒毛间质少许染色，PTEN在正常妊娠滋养细胞胞质和细胞核及绒毛间质中均有表达，表达量较多，呈深棕色，见图3。平均光密度值显示，试验组绒毛组织PTEN 蛋白相对表达量（0.036±0.016）低于对照组绒毛组织（0.084±0.013），差异有统计学意义（t=-7.156，P=0.000），见图4。

2.4两组绒毛组织中miR-19b与PTEN表达的相关性分析  将组内绒毛组织中miR-19b与PTEN表达进行Pearson相关性分析，显示正常妊娠组中miR-19b与PTEN的表达呈显著负相关性（r=-0.584，P=0.001），见图5。

3讨论

近年来，稽留流产的发病率呈上升趋势，极大的影响女性身心健康。因此，寻找确切的病因以及有效的诊断标志物，对于稽留流产的诊断以及治疗具有非常重要的临床意义。目前稽留流产的发病机制尚不清楚，其研究多集中于滋养细胞侵袭力下降及过度凋亡、胎盘血管生成障碍、母胎界面免疫耐受平衡失调，以及基因多态性改变等。

已有研究证实[9-11]，miRNAs调节许多生化途径，如细胞增殖、分化和凋亡，miRNAs表达失调与许多疾病有关，包括不孕症、子宫内膜异位症、先兆子痫、肿瘤发生以及神经、心血管和代谢疾病。自然流产胎盘绒毛组织中存在miRNA的异常表达[4]，这些异常表达通过细胞增殖、凋亡及免疫调节参与了流产的发生发展。研究发现，过表达miRNA-23-3p、miRNA-29a-3p可抑制滋养细胞HTR8/SVneo侵袭性[3]，miRNA-149-3p可能通过上调MAPK信号通路和Notch信号通路影响细胞的增殖、分化和凋亡，干扰胚胎发育、血管生成和胎盘血管等生理变化[12]。Liu HN等[13]通过原位杂交发现与正常女性相比，复发性流产患者绒毛组织中miRNA-93显著升高，进一步实验证明上调miRNA-93可通过靶向调节因子BCL2L2，抑制滋养细胞增殖、迁徙以及侵袭。Ding J等[14]实验发现在复发性流产患者中miRNA-27a-3p通过负性调控USP25表达，抑制滋养细胞上皮间充质转化、侵袭和迁移能力，参与复发性流产的发生。本研究显示，试验组绒毛组织miR-19b表达升高，而miR-19b有报道在多种肿瘤细胞中高表达[15]，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭与凋亡，妊娠前3个月人类滋养细胞和肿瘤细胞具有相似的内在侵袭特性。因此，推测miR-19b可能参与了滋养细胞增殖、侵袭和凋亡过程，进而参与了稽留流产的发生发展。

PTEN参与了许多细胞增殖和凋亡过程，许多miRNAs与PTEN有功能性相互作用，并抑制其表达。在卵巢癌中，miR-19b的过表达显著降低了PTEN的表达[16]。miR-19b可以靶向PTEN来调节宫颈癌细胞的增殖、侵袭和自噬[17]。miR-19b通过靶向PTEN抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡，促进增殖[18]。除了肿瘤相关疾病外，miR-19b与PTEN在其他疾病中也存在相互作用。miR-19b可通过下调PTEN激活AKT信号通路，保护心肌细胞凋亡[19]。研究表明绒毛滋养层的PTEN表达随着妊娠的进展而减少。本研究显示试验组绒毛组织PTEN mRNA及蛋白表达下降，证明PTEN参与了滋养细胞的异常作用。先前在动物实验中显示，PTEN基因缺失的小鼠表现出异常的外胚层和中胚层，以及有缺陷的胎盘形成[20]。此外，异常的PTEN表达可能通过与其miRNA的互补序列结合而参与miRNA的调节。本研究显示miR-19b与PTEN呈负相关，因此推测miRNA可能通过靶向PTEN调节滋养细胞增殖、侵袭和凋亡，从而参与了稽留流产的发生。

综上所述，稽留流产患者绒毛组织miR-19b过表达，PTEN低表达，呈负相关，miR-19b可能通过PTEN参与了滋养细胞增殖、凋亡过程。

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