硫酸吲哚酚对心肌梗死模型小鼠心肌重构的影响

冯鲁信 刘涛 徐庆玲 万浩然 孙志雨 郭俊杰

［摘要］ 目的

探讨硫酸吲哚酚（IS）对心肌梗死（myocardial infarction， MI）模型小鼠心肌重构的影响。

方法 C57BL/6J成年雄性小鼠50只，随机分为假手术组（Sham组）10只，硫酸吲哚酚组（Sham+IS组）10只，心肌梗死组（MI组）15只，心肌梗死+硫酸吲哚酚组（MI+IS组）15只。采用左前降支冠状动脉结扎术构建小鼠MI模型，术后第24小时，Sham+IS组和MI+IS组小鼠每天腹腔注射IS 100 mg/kg，Sham组和MI组每天腹腔注射等体积PBS，连续28 d，期间记录各组小鼠存活情况。实验第30天，心脏超声检查评估各组小鼠心脏功能，超高效液相色谱法检测各组小鼠血清中IS浓度，Masson染色评估各组小鼠梗死区心肌纤维化程度，RT-qPCR技术检测心肌组织α-sma、CollagenⅠ基因的表达水平，Western blot技术检测心肌组织TGF-β信号通路标记蛋白TGF-β、p-Smad2、p-Smad3的表达水平。

结果 实验第30天时，与MI组相比，MI+IS组小鼠存活率显著下降（χ2=5.02，P<0.05）。与Sham组相比，Sham+IS组小鼠血清中IS浓度显著升高（t=54.87，P<0.05），与MI组相比，MI+IS组小鼠血清中IS浓度显著升高（t=38.55，P<0.05）。心脏超声检查示，Sham组和Sham+IS组的小鼠左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）无显著差异（P>0.05）；与MI组相比，MI+IS组小鼠LVIDd、LVIDs显著增大（t=3.96、4.31，P<0.05），LVEF、LVFS显著降低（t=5.68、4.07，P<0.05）。Masson染色示，MI+IS组与MI组比较小鼠心肌间质胶原纤维沉积明显增多。RT-qPCR技术检测显示，MI+IS组与MI组相比，小鼠心肌组织α-sma、CollagenⅠ基因的表达水平显著升高（t=8.74、4.78，P<0.05）。Western blot方法检测显示，MI+IS组与MI组相比小鼠心肌组织中TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表达水平均显著升高（t=4.04～5.64，P<0.05）。

结论 IS可加重小鼠MI后病理性心肌重构，其机制可能与TGF-β信号通路激活相关。

［关键词］ 靛甙；心肌梗死；疾病模型，动物；心室重构；转化生长因子β；信号传导

［中图分类号］ R542.22    ［文献标志码］ A

在全球范围内，心肌梗死（MI）仍是导致人类死亡的主要原因之一，尽管再灌注治疗策略在一定程度上降低了患者的病死率，但MI后心力衰竭的发生，仍对患者的预后构成严重威胁[1]。以心肌肥大、心肌纤维化等为特征的病理性心肌重构是MI后心力衰竭发生的重要机制之一[2]。硫酸吲哚酚（IS）是一种小分子蛋白结合型尿毒症毒素[3]，与心力衰竭、心律失常等心血管疾病的发生密切相关[4-7]，但目前IS对MI后病理性心肌重构的影响尚不明确。本研究通过检测IS对MI模型小鼠存活率、心功能等的影响，探讨IS对MI后心肌重构的影响及其作用机制，旨在为MI后病理性心肌重构的干预治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与材料

成年雄性C57BL/6J小鼠50只，8～10周龄，体质量20～22 g，购买于北京华阜康生物科技公司。IS、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购买于美国MedChemExpress公司。TRIzol购自美国Invitrogen公司。RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。Masson染色液购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 动物分组及MI模型的构建

将小鼠随机分为四组，即假手术组（Sham组）10只，硫酸吲哚酚组（Sham+IS组）10只，心肌梗死组（MI组）15只，心肌梗死+硫酸吲哚酚组（MI+IS组）15只。所有小鼠予以2%异氟烷吸入麻醉后，在动物呼吸机支持下开胸并暴露心脏，MI组和MI+IS组小鼠采用左前降支冠状动脉结扎术构建MI模型，用6-0丝线在左心耳下缘2～3 mm处结扎，结扎点以下至心尖部心肌泛白，提示造模成功；Sham组和Sham+IS组小鼠将6-0丝线在左心耳下缘2～3 mm处穿过，不进行结扎。术后24 h，Sham+IS组以及MI+IS组小鼠每天腹腔注射IS 100 mg/kg，Sham组及MI组小鼠每天腹腔注射等体积PBS，均连用28 d。期间记录各组小鼠生存情况，计算各组小鼠的存活率。

1.3 心脏超声检查评估小鼠心脏功能

在实验第30天时，各组小鼠以2%异氟烷吸入麻醉，使用VINNO 6 LAB型动物超声成像系统（苏州飞依诺科技有限公司），在小鼠乳头肌水平的胸骨旁长轴视图中记录二维引导的M型图像。通过设定的标准公式计算左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室射血分数（LVEF）。

1.4 超高效液相色谱（UPLC）法检测小鼠血清中IS浓度

心脏超声检查结束后，眼球取血法收集各组小鼠血液样本，置于不含抗凝剂试管中，4 ℃静置过夜后，以3 000 r/min室温离心10 min，上清液即为血清，将血清置于1.5 mL的EP管中。参考既往研究方法[8]，用UPLC法检测各组小鼠血清IS浓度。

1.5 Masson染色评估小鼠心肌组织纤维化水平

各组小鼠眼球取血后，颈椎脱臼法处死，剥离心脏，每组随机选取3只小鼠心脏组织，生理盐水冲洗后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脱水后，将心脏组织包埋在石蜡中。使用Masson染色液对心脏组织石蜡切片（厚度3～5 μm）进行染色，光学显微镜下观察各组小鼠心肌间质胶原纤维沉积情况。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测小鼠心肌组织α-sma、Collagen Ⅰ基因的表达水平

将各组小鼠剩余所有心肌组织漂洗后剪碎，分别随机称取30 mg置于1.5 mL离心管，每管加入1 mL TRIzol后在组织研磨仪中充分研磨，按照试剂盒说明书的操作要求完成总RNA提取，－80 ℃保存备用。按照反转录试剂盒说明书步骤将1 μg RNA反转录为cDNA，继而以此为模板进行RT-qPCR。实验所用引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，引物序列：α-sma F：5′-TGGAGCCTCATGTACCTGGTAACC-3′，α-sma R：5′-CTGCCGATCFCTGCCAATCACTG-3′；CollagenⅠ F：5′-ACAGGCGAACAAGGTGACAGAG-3′，CollagenⅠ R：5′-AGGAGAACCAGGAGAACCAGGAG-3′；GAPDH F：5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGGGCTC-3′，GAPDH R：5′-TGGAAG-

AGTGGGAGTTGCTGTTGA-3′。以GAPDH为内参照，采用2-△△CT方法计算目的基因的相对表达量。实验重复3次，结果取均值。

1.7 蛋白质印迹（Western blot）法检测小鼠心肌组织TGF-β信号通路相关标记蛋白表达水平

随机取每组小鼠心肌组织碎块各20～30 mg置于1.5 mL EP管中，按照RIPA裂解液∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂=100∶1∶1的比例，每管中加入300 μL的总裂解液，充分研磨后冰上静置30 min，提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后加入SDS-PAGE上样缓冲液蛋白loading buffer，98 ℃煮沸10 min变性，待冷却后－80 ℃储存备用。蛋白样品（20～30 μg）以10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转膜1 h，使用快速封闭液（QuickBlockTM Blocking Buffer）封闭15 min以后，依次加入兔抗鼠TGF-β多克隆抗体（1∶500）、兔抗鼠Smad2/3单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗鼠p-Smad2单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗鼠p-Smad3单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗鼠GAPDH多克隆抗体（1∶10 000）后，于4 ℃孵育过夜，以TBST溶液清洗后，加入山羊抗兔二抗（1∶5 000）室温孵育1.5 h，使用超敏ECL发光液显影。使用Image J软件分析相关蛋白的灰度值，以GAPDH为内参照，目的蛋白的相对表达水平以目的蛋白灰度值/内参照蛋白灰度值表示。实验重复3次，结果取均值。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计分析，计量资料以[AKx-D]±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验。绘制Kaplan-Meier生存曲线，采用log-rank检验比较四组间生存率有无统计学差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 IS对各组小鼠存活率的影响

实验第30天时，Sham组与Sham+IS组小鼠全部存活，MI组小鼠存活13只，MI+IS组小鼠存活7只，Kaplan-Meier生存分析显示，各组小鼠存活率比较差异有显著性（χ2=16.95，P<0.05），其中MI+IS组与MI组、Sham组、Sham+IS组相比，小鼠存活率显著降低（χ2=5.02～7.20，P<0.05），Sham组与Sham+IS组、Sham组与MI组、MI组与Sham+IS组相比，小鼠存活率差异无显著意义（P>0.05）。见图1。

2.2 IS对各组小鼠心脏功能的影响

实验第30天时，心脏超声检查结果显示，四组小鼠的心脏功能各项指标比较差异均具有显著性（F=48.41～140.60，P<0.05）；其中MI+IS组与MI组、MI组与Sham组、MI组与Sham+IS组各项指标比较差异均有显著性（t=3.96～14.54，P<0.05），Sham+IS组与Sham组各项指标比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。

2.3 各组小鼠血清中IS浓度比较

实验第30天时，Sham组、Sham+IS组、MI组及MI+IS组小鼠血清IS浓度分别为（0.09±0.01）、（3.09±0.17）、（0.13±0.03）、（3.27±0.22）mg/L，各组小鼠血清中IS浓度比较差异具有显著意义（F=1 449.00，P<0.05）；Sham+IS组与Sham组、MI+IS组与MI组、Sham+IS组和MI组比较，血清中IS的浓度显著升高（t=38.55～54.87，P<0.05），Sham组和MI组比较血清中IS浓度差异无显著性（P>0.05）。

2.4 IS对各组小鼠心肌纤维化的影响

各组小鼠心肌组织的Masson染色结果显示，Sham组和Sham+IS组未见异常胶原纤维沉积，MI组和Sham组相比，可见明显的胶原纤维沉积，MI+IS组和MI组比较，心肌间质胶原纤维沉积明显增多（图2），图中蓝色染色部分为沉积的心肌间质胶原纤维。各组小鼠α-sma、CollagenⅠ基因表达水平比较差异有显著性（F=101.30、64.90，P<0.05）；MI+IS组与MI组、MI组与Sham组比较，α-sma、CollagenⅠ表达水平差异具有显著意义（t=4.22～8.80，P<0.05），但Sham和Sham+IS组间比较差异无显著性（P>0.05）。见表2。

2.5 IS对心肌组织中TGF-β信号通路相关标记蛋白表达的影响

Western blot方法检测结果显示，各组间心肌组织中TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平比较差异具有显著性（F=88.48～200.30，P<0.05）；MI+IS组和MI组、MI组和Sham组比较，TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平均性增高，差异具有显著统计学意义（t=4.04～18.91，P<0.05），但Sham+IS组和Sham组比较差异无显著性（P>0.05）。见表3。

3 讨  论

得益于再灌注治疗策略的开展，MI患者的病死率近几年显著下降，但梗死后心力衰竭的发生仍然是影响患者长期预后的重要因素之一[2]，而病理性心肌重构则是梗死后心力衰竭发生的关键原因，其病理过程涉及心肌肥厚、心肌纤维化、炎症过度激活、细胞代谢失衡以及血管再生抑制等[2，8]。研究表明，与肾功能正常MI患者相比，慢性肾脏疾病（CKD）患者MI病死率显著升高[10-11]，其中，尿毒症毒素作为CKD相关危险因素在MI后心肌病理性改变过程中发挥重要作用[12]。IS因其蛋白结合特性，常规透析治疗对其清除效果差[13]。临床研究发现，IS可加重稳定型心绞痛或经皮冠状动脉介入术后患者的左心室舒张功能不全[14]。此外，当透析患者血液中IS水平超过32.35 mg/L时，其首次心力衰竭事件的发生率显著升高[15]。

本研究中发现，与MI组相比，MI+IS组小鼠生存率显著降低。为评估IS对MI后心脏功能的影响，对各组小鼠进行心脏超声检查，结果显示，与MI组相比，MI+IS组小鼠心脏收缩功能显著降低，但Sham组和Sham+IS组间无显著差异，提示IS可能通过促进MI后的病理性心肌重构，加重MI后的心功能障碍，导致小鼠MI后生存率显著下降。与本研究发现一致，在达尔盐敏感型高血压大鼠模型中，IS通过激活心肌组织中AhR/NF-κb信号通路促进NLRP3炎症小体表达升高，导致大鼠心功能障碍加重[16]。心肌纤维化是病理性心肌重构的基本病理改变之一，本研究中，Masson染色结果显示，与MI组相比较，MI+IS组小鼠心肌间质胶原纤维沉积显著增多；RT-qPCR结果显示，与MI组相比较，MI+IS组小鼠心肌组织纤维化相关基因α-sma、CollagenⅠ表达水平显著增高，Sham+IS组和Sham组相比差异无显著性，提示IS可能通过加重小鼠心肌纤维化，加速MI后病理性心肌重构的进展。

心肌纤维化是指细胞外基质（ECM）蛋白，例如Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ，在心肌间质的过度沉积。MI发生后，过度和持续的刺激（如尿毒症毒素）可诱导心肌成纤维细胞分化、增殖活动增强，导致胶原纤维大量分泌、ECM成分（如TGF-β因子、基质金属蛋白酶等）过度激活[17]。其中，TGF-β信号通路在组织纤维化过程中发挥着重要作用[18]，活化状态下TGF-β通过诱导其下游Smad2、Smad3磷酸化，来促进肌成纤维细胞的活化和增殖，以及ECM的生成[19-20]。磷酸化的Smad3可以直接调节α-sma及ECM蛋白如胶原纤维的表达[19]。为明确IS是否通过调控TGF-β信号通路参与MI后心肌纤维化过程，本研究对各组小鼠心肌组织行Western blot检测，结果显示，与MI组相比，MI+IS组小鼠心肌组织中TGF-β、p-Smad2、p-Smad3表达水平均显著升高，但Sham组和Sham+IS组间无显著性差异，表明IS促进MI后心肌TGF-β信号通路的持续激活。SUN等[21]和CAI等[22]的研究也表明，在近端肾小管细胞中，IS可诱导TGF-β信号通路的激活，与本研究结果一致。

综上所述，IS可通过激活MI后小鼠心肌组织TGF-β信号通路，促进MI后小鼠心肌纤维化进程，加速小鼠的病理性心肌重构。本研究为降低CKD患者MI后的高病死率提供了新思路，为提高CKD患者的长期生存率提供了实验数据支持。

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的动物实验均已通过青岛大学实验动物福利伦理委员会审核批准（文件号20230330C57562023-0730006）。所有实验均遵照《实验动物管理条例》规定进行。

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