纤维蛋白溶解系统和转化生长因子—1在子宫全切除术后腹腔粘连发病机制中的作用

赵小迎++金纬纬

[摘要] 目的 檢测组织纤溶酶原激活物（t-PA）、纤溶酶原激活剂抑制物（PAI-1）和转化生长因子-β（TGF-β）在术后腹腔粘连中的表达，分析其在子宫全切除术后腹腔粘连发生发展过程中的作用，探讨腹腔粘连发生机制。 方法 选择本院子宫肌瘤患者60例，均行子宫全切除术，开腹手术30例（开腹组），腹腔镜手术30例（腹腔镜A组），收集同期行腹腔镜下卵巢囊肿剥除术病例30例（腹腔镜B组）。开腹组腹膜打开后、术中间隔30 min、关腹前，腹腔镜组在气腹形成后、术中间隔30 min、结束气腹前分别取外周血5 mL和腹膜；并于术后1 d、2 d、3 d 抽取外周静脉血5 mL，检测血液 t-PA、PAI-1浓度，组织 TGF-β 蛋白和 TGF-β基因表达。 结果 开腹组术中、关腹前血清 t-PA 为（27.79±1.76）ng/L和（24.68±1.73）ng/L，低于腹腔镜A组和B组患者，开腹组术中、关腹前血清 PAI-1为（22.46±1.22）μg/L和（24.31±1.80）μg/L，高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学意义（P<0.05）。开腹组关腹前组织 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因分别为（2.59±0.63）和（34.74±1.92），均高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学意义（P<0.05）；开腹组术后1 d、2 d、3 d 血清 t-PA 低于腹腔镜A组和B组患者，PAI-1 高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 开腹组患者 PAI-1、TGF-β 蛋白和基因表达呈现较强表达，PAI-1 随着手术时间的延长而增加，t-PA 浓度显著降低，随着手术时间的延长而下降。

[关键词] 腹腔粘连；腹腔镜术；组织纤溶酶原激活物；纤溶酶原激活剂抑制物等；转化生长因子-β

[中图分类号] R713.4+2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）09-0001-04

The role of fibrinolytic system and transforming growth factor-1 in the pathogenesis of peritoneal adhesions after total hysterectomy

ZHAO Xiaoying JIN Weiwei

Department of Obstetrics and Gynecology，Wenzhou Traditional Chinese and Western Medicine Hospital in Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of tissue plasminogen activator（t-PA）， plasminogen activator inhibitor（PAI-1）and transforming growth factor-β（TGF-β） in postoperative peritoneal adhesions， and to analyze their role in the development of abdominal adhesions after total hysterectomy，and to explore mechanism of abdominal adhesions. Methods 60 patients with uterine leiomyoma were enrolled in this study. All patients underwent total hysterectomy. There were 30 patients undergoing laparotomy（laparotomy group） and 30 patients undergoing laparoscopic surgery （laparoscopic group A）.30 cases of laparoscopic ovarian cystectomy in the same period were collected （laparoscopic group B）. 5 mL peripheral blood and peritoneum were taken after the opening of peritoneum，intraoperative interval of 30 minutes and before the closing of abdomen in the laparotomy group and after the formation of pneumo-peritoneum， intraoperative interval of 30 minutes and before the end of pneumoperitoneum in the laparoscopic group. The expression levels of blood t-PA， PAI-1 concentration， and TGF-β protein and TGF-β gene in tissue were detected by immunohistochemistry at first day， second day and third day after operation. Results The levels of serum t-PA during surgery and before the closing of abdomen were（27.79±1.76）ng/L and（24.68±1.73）ng/L in laparotomy group， which were lower than those of laparoscopic group A and group B. And the levels of serum PAI-1 during surgery and before the closing of abdomen were（22.46±1.22）μg/L and（24.31±1.80）μg/L ，which were higher than those of laparoscopic group A and group B. And the differences were significant（P<0.05）. The levels of tissue TGF-β protein and TGF-β gene were （2.59±0.63） and （34.74±1.92） in the laparotomy group， which were significantly higher than those in the laparoscopic group A and group B， and the differences were significant（P<0.05）. The serum t-PA level in laparotomy group was lower than that in the laparoscopic group A and group B at first day， second day and third day after operation. And the level of PAI-1 in laparotomy group was higher than that in laparoscopic group A and group B， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion PAI-1， TGF-β protein and gene in the laparotomy group were strongly expressed in the laparotomy group. t-PA concentration decreased significantly， and decreased with the operation time.

[Key words] Peritoneal adhesions；Laparoscopy；Tissue plasminogen activator；Plasminogen activator inhibitors；Transforming growth factor-β

腹腔术后出现腹腔粘连是长期困绕外科手术的一个难题，腹膜对手术的反应取决于手术创伤的程度，形成机制复杂[1]。有研究[2-3]认为血浆纤维蛋白溶解系统的活性对于腹腔粘连的溶解具有重要作用，多种细胞的迁移和增生及各种生长因子和细胞因子的了腹腔粘连过程，如组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）、纤溶酶原激活剂抑制物（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）等。组织中转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是启动和终止组织修复的一种肽类生长因子[4-5]。本研究旨在检测t-PA、PAI-1和 TGF-β 在术后腹腔粘连中的表达水平，分析其在腹腔粘连发生发展过程中的作用，探讨腹腔粘连发生机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院2014年1月～2015年12月子宫肌瘤患者60例，均行子宫全切除术，开腹手术30例（开腹组），腹腔镜手术30例（腹腔镜A组）收集在本院因“良性卵巢囊肿”行腹腔镜下卵巢囊肿剥除术的病例30例（腹腔镜B组）。开腹组患者年龄36～62岁，平均（44.19±8.24）岁，腹腔镜A组患者年龄35～61岁，平均（44.08±8.31）岁；腹腔镜B组患者年龄37～62岁，平均（44.29±8.54）岁，各组入选研究对象年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

开腹组腹膜打开后、术中间隔30 min、关腹前分别取腹膜约 0.5 cm×0.5 cm，并抽取外周静脉血 5 mL，腹腔镜A组和B组在气腹形成后、术中间隔30 min、结束气腹前取空腹外周静脉血 5 mL 和腹膜约 0.5 cm×0.5 cm；手术结束后1 d、2 d、3 d 抽取清晨空腹外周血 5 mL。血液样本-20℃保存备用，组织样本-80℃保存备用。ELISA法测定血液标本 t-PA、PAI-1 浓度。免疫组化法和 real-time PCR 检测组织标本中 TGF-β 蛋白和 TGF-β 基因表达。

免疫组化法主要步骤：10% 福尔马林组织固定、石蜡包埋、切片，脱蜡、梯度酒精水化；抗原修复，滴加 3% H2O2。滴加非免疫血清阻断非特异反应；滴加 TGF-β 一抗（工作浓度1∶50）；滴加二抗和底物显色液，苏木素复染；二甲苯、封片。兔抗人 TGF-β 多克隆抗体免疫组化试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）。光镜下观察，每张片子取 5个高倍视野，每个视野下计数 100 个瘤细胞，半定量积分法对每张切片细胞进行染色强度分级记分，无着色（0分）、淡黄色（1分）和棕褐色（2分），按阳性细胞面积计0（0分）、1%～25%（1分），26%～50%（2分）、51%～75%（3分）、76%～100%（4分），将两项乘积进行评估其阳性表达强度评估。

RT-qPCR步骤：反转录（依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA）、扩增（用PCR的方法扩增cDNA）、检测（检测和定量扩增的产物）。对硝酸纖维素膜进行扫描并进行灰度分析。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 19.0 对数据进行统计学处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，多组间计量资料采用F检验，计数资料比较用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组开腹前血清t-PA、PAI-1和组织 TGF-β蛋白、TGF-β基因结果比较

三组术前各项结果比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.2 三组术中血清 t-PA、PAI-1和组织 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因结果比较

开腹组术中血清 t-PA 为低于腹腔镜A组和B组患者，开腹组术中血清 PAI-1 高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 三组关腹前血清t-PA、PAI-1和组织TGF-β蛋白、TGF-β基因结果比较

开腹组关腹前血清t-PA低于腹腔镜A组和B组患者，开腹组关腹前血清PAI-1和组织TGF-β蛋白、TGF-β基因均高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4三组术后不同时间血清t-PA和PAI-1结果比较

开腹组术后1 d、2 d、3 d血清t-PA低于腹腔镜A组和B组患者，PAI-1高于腹腔镜A组和B组患者，且随着术后时间的延长，血清t-PA和PAI-1水平呈现下降和上升趋势，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

腹腔疾病术后粘连发生率达 90% 以上，是剖腹术后一个重大难题。腹膜受到损伤时，大量吞噬细胞迁移并诱导成纤维细胞至创面，激活成纤维细胞产生胶原，并释放多种生长因子与蛋白酶，破坏纤维蛋白溶解与合成平衡，使过度生成的胶原纤维无法被正常溶解与代谢，细胞外基质沉积而导致粘连的形成[6-8]。腹膜对手术的反应取决于手术创伤的程度，最小程度的侵入手术方式可减少术后腹腔粘连的严重程度。腹腔镜手术具有腹膜损伤小，术后粘连发生率低等优点[9-10]。

多种细胞的迁移、增生及细胞因子参与了粘连过程，其中纤维蛋白原的释放与溶解的失衡具有关键作用[11]。t-PA 是一种含527个氨基酸的单链糖蛋白，分子量6.8万～7.2万，为丝氨酸蛋白酶，通过裂解纤溶酶原肽键而发挥纤溶作用。PAI 是t-PA的拮抗剂，t-PA和PAI 可反映纤维蛋白沉积和降解之间的平衡，其相互作用决定了腹膜腔纤溶系统的活性。TGF-β 是多肽链组成的二聚体，TGF-β1是TGF-β家族中重要的促纤维化因子，是目前已知对纤维化形成和发展等关键细胞因子，可刺激间质细胞增殖产生 ECM，诱导体内各种组织纤维化反应[12-14]。

本次研究结果显示，开腹组术中关腹前血清 t-PA和组织 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因表达均高于腹腔镜A组和B组患者，开腹组术中血清 PAI-1 低于腹腔镜A组和B组患者。提示传统开腹手术引起术后腹腔粘连形成的可能性大，过表达的 TGF-β1 诱导成纤维细胞过度增殖与胶原合成。手术损伤腹腔，TGF-β1被激活并过量表达，激活 TGF-β1/Smad 信号通路，上调下游 PAI-1 的表达，下调腹膜内 t-PA 表达，增强成纤维细胞活性，抑制腹膜纤溶活性，促进成纤维细胞的过量增殖及毛细血管长入，促进多种胶原蛋白合成并在受损部位沉积，诱发粘连带的形成[15-17]。纤维溶解酶作为体内纤维蛋白降解的重要参与者，其活化主要依靠 t-PA，t-PA 能激活纤溶酶原为纤溶酶，将纤维蛋白原和纤维蛋白降解，降低纤维的合成。t-PA 可被体内的 PAI-1所拮抗，受其调节[18-19]。本次研究结果显示，术后1 d、2 d、3 d，腹膜 t-PA明显下降、PAI-1明显增加，引起术后粘连的可能性也增加。随着手术时间延长，纤维蛋白原的释放和纤维蛋白原的溶解之间的失衡加剧，增加术后粘连的可能性。腹腔镜手术对腹膜的损伤小，术中气腹使组织创面相互分离，降低接触机会，术后腹膜缝线反应轻，均有效降低了腹膜粘连程度[20]。腹腔镜中，气腹的特定情况可能激活了形成粘连的各种机制，气体的选择、湿度、温度和腹内压可能决定了粘连的形成和血浆纤维蛋白溶解系统的活性，需要进一步进行研究。

综上所述，开腹组患者PAI-1、TGF-β蛋白和基因表达呈现较强表达，PAI-1随着手术时间的延长而增加，浓度显著降低，随着手术时间的延长而下降。腹腔镜术通过降低腹膜在受到损伤TGF-β1和PAI-1的过表达，上调t-PA，实现防治术后腹膜粘连发生和发展。

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（收稿日期：2016-11-21）