3′tRF-PheGAA对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的调控作用及其机制

程雪丽 王凯 赵炎 王昆

［摘要］ 目的

探讨3′tRF-PheGAA对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心肌细胞肥大的调控作用及其机制。

方法 获取小鼠乳鼠的原代心肌细胞，培养24 h以后分为A～G组。其中A组使用DMEM/F12完全培养液培养心肌细胞36 h；B组使用NC转染心肌细胞36 h；C组使用agomir-3′tRF-PheGAA转染心肌细胞36 h；D组使用DMEM/F12完全培养液培养心肌细胞84 h；E组在心肌细胞中加入终浓度为1 μmol/L的AngⅡ处理48 h；F组使用anta-NC转染心肌细胞36 h，随后加入终浓度1 μmol/L的AngⅡ处理48 h；G组使用anta-3′tRF-PheGAA转染心肌细胞36 h，随后加入终浓度1 μmol/L的AngⅡ处理48 h。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测各组心肌细胞中3′tRF-PheGAA及心房钠尿肽（ANP）、脑钠肽（BNP）、β-重链肌球蛋白（β-MHC）基因表达水平；使用罗丹明标记鬼笔环肽对各组心肌细胞中F-肌动蛋白进行染色并计算心肌细胞骨架表面积。

结果 RT-qPCR检测结果显示，A～C组心肌细胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因水平差异具有显著性（F=137.10～1 061.00，P＜0.05），其中与A组相比，C组3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因水平显著上调（P＜0.05）；D～G组心肌细胞3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因表达水平差异有显著性（F=117.60～572.30，P＜0.05），其中与E组相比，G组3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因表达水平显著降低（P＜0.05）。罗丹明标记的鬼笔环肽染色结果显示，A～C组心肌细胞骨架表面积差异有显著性（F=35.06，P＜0.05），其中与A组相比，C组细胞骨架表面积显著增加（P＜0.05）；D～G组心肌细胞骨架表面积差异有显著性（F=48.05，P＜0.05），其中与E组相比，G组细胞骨架表面积显著减少（P＜0.05）。

结论 3′tRF-PheGAA通过抑制自身表达，从而缓解AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

［关键词］ RNA，非翻译小片段；血管紧张素Ⅱ；肌细胞，心脏；心脏扩大

［中图分类号］ R541    ［文献标志码］ A

近年来随着社会工作节奏加快和人民生活水平提高，青年人心血管疾病的发病率和死亡率逐年上升[1]。心肌肥厚是由于心脏为适应超负荷工作而导致的病理性肥厚，其最终可导致患者心律失常、心力衰竭甚至死亡。随着高通量RNA测序广泛应用，越来越多的非编码RNA被发现。tsRNA是一种新发现的功能性非编码小RNA，是tRNA的衍生片段（tRFs），由特定的核酸酶裂解而成[2]。根据前体或者成熟tRNA的切割位置不同，tsRNA一般可分为5′RNA半体、3′tRNA半体、tRF-1、5′UtRF、3′tRF、5′tRF和tiRNA[3-4]。有研究发现tsRNAs可以调节细胞和组织的基因表达、蛋白质翻译及应激反应，并在细胞周期、细胞间通讯、表观遗传及抗细胞凋亡等基本生物学过程中发挥作用[5-8]， 同时tsRNAs可能参与心肌细胞肥大的病理生理过程[9]。血管紧张素（Ang）是心脏肥大和心力衰竭的生物标志物，也属于核糖核酸内切酶家族，可调节tsRNAs的生物发生和降解[9]。本课题组前期实验发现3′tRF-PheGAA在肥大心肌组织及AngⅡ诱导的心肌细胞中均呈高表达，但其具体作用尚不清楚。本研究旨在探究3′tRF-PheGAA在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中的调控作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1～3日龄雌雄不限的小鼠乳鼠购自青岛大任富城畜牧有限公司，DMEM/F12培养基购自武汉谱诺赛生物科技有限公司，RNA逆转录试剂盒购自杭州艾科瑞生物科技有限公司，SYBR Green qPCR Master Mix购买于苏州莫纳生物科技有限公司，GAPDH和U6购自上海生工生物工程技术服务有限公司，Lipo8000TM转染试剂购自上海碧云天生物技术股份有限公司，罗丹明标记鬼笔环肽购自上海翊圣生物科技有限公司，胎牛血清购自苏州依科赛生物科技股份有限公司，Ⅱ型胶原酶购买于美国Worthington公司，胰液素购自美国西格玛公司，青/链霉素购自北京索莱宝生物科技有限公司，4%多聚甲醛购自广州赛国生物科技有限公司。

1.2 小鼠乳鼠原代心肌细胞的获取及培养

使用体积分数0.75的乙醇溶液清洁小鼠乳鼠，并置于冰砖上低温麻醉，接着使用弯剪剪开小鼠左胸腔，取出小鼠心脏置于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中清洗，然后剪碎并收集到锥形瓶中。在锥形瓶中加入5 mL由2 mL Ⅱ型胶原酶（0.2 g/L）、700 μL胰液素（0.14 g/L）和47.3 mL PBS配制的消化液，将锥形瓶在37 ℃水浴锅中消化7 min，收集上清液至装有体积分数0.05的胎牛血清的离心管中，置于冰上备用。重复上述消化步骤7～8次至组织块消失以后，将收集的所有上清液以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀中加入DMEM/F12培养液重悬。再以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀中加入DMEM/F12完全培养液（含体积分数0.05的胎牛血清及体积分数0.01的青/链霉素混合液）重悬。使用300目过滤网过滤重悬液，收集滤液至培养皿，在37 ℃含体积分数0.05的CO2的培养箱中差速贴壁培养1.5 h，未贴壁的上清液即为小鼠乳鼠原代心肌细胞，已贴壁的细胞为成纤维细胞。将两种细胞根据后续实验需求接种于培养皿中，贴壁24 h后换液，用于后续实验。

1.3 小鼠乳鼠心肌细胞的分组及转染

将小鼠乳鼠心肌细胞分别接种于6、24孔板中，当细胞融合度达70%～80%时，按照Lipo8000TM转染试剂说明书进行转染。具体步骤如下：A组使用DMEM/F12完全培养液培养小鼠乳鼠心肌细胞36 h；B组使用NC转染心肌细胞36 h；C组使用agomir-3′tRF-PheGAA转染心肌细胞36 h；D组使用DMEM/F12完全培养液培养心肌细胞84 h；E组在心肌细胞中加入终浓度1 μmol/L的AngⅡ处理48 h[10]；F组使用anta-NC转染心肌细胞36 h，随后加入终浓度1 μmol/L的AngⅡ处理48 h；G组使用anta-3′tRF-PheGAA转染心肌细胞36 h，随后加入终浓度1 μmol/L的AngⅡ处理48 h。另取一部分1.2中得到的成纤维细胞和心肌细胞，分别接种于6孔板中，使用DMEM/F12完全培养液培养24 h以后，用于实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。

1.4 RT-qPCR技术检测各组小鼠乳鼠心肌细胞和成纤维细胞中3′tRF-PheGAA及心肌肥大标志物基因表达水平

使用Trizol法提取1.3中得到的A～G组心肌细胞总RNA，反转录获得cDNA，随后使用RT-qPCR技术检测心肌细胞中3′tRF-PheGAA（U6为内参）和心肌肥大标志物心房钠尿肽（ANP）、脑钠肽（BNP）、β-重链肌球蛋白（β-MHC）（GAPDH为内参）mRNA表达水平。提取1.3中培养24 h的成纤维细胞和心肌细胞总RNA，反转录获得cDNA，随后检测3′tRF-PheGAA的表达水平。结果取3次实验均值。引物名称及序列见表1。

1.5 小鼠乳鼠心肌细胞骨架表面积计算

将步骤1.3的24孔板中各组心肌细胞用PBS洗涤3次后，使用4%多聚甲醛固定15 min，根据罗丹明标记鬼笔环肽说明书中的要求进行染色，封片后于-20 ℃条件下保存，通过普通荧光显微镜观察细胞骨架并拍照，使用Image J软件测量纤维状肌动蛋白（F-肌动蛋白）染色表面积以评估心肌细胞肥大情况。实验重复5次，结果取均值。

1.6 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以[AKx-D]±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Turkey检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 小鼠乳鼠心肌细胞和成纤维细胞中3′tRF-PheGAA相对表达水平比较

RT-qPCR结果显示，3′tRF-PheGAA在心肌细胞和成纤维细胞中表达水平分别为1.00±0.02、0.26±0.03，心肌细胞中3′tRF-PheGAA表达水平较成纤维细胞显著升高（t=35.90，P＜0.05）。

2.2 A～C组小鼠心肌细胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达水平及细胞骨架表面积比较

RT-qPCR技术检测结果显示，三组心肌细胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC表达水平差异有显著性（F=137.10～1 061.00，P＜0.05），其中与A组相比，C组上述指标表达水平均显著增加（P＜0.05）。罗丹明标记鬼笔环肽染色结果显示，三组心肌细胞骨架表面积分别为（1.00±0.10）、（1.03±0.10）和（1.66±0.19）μm2，三组比较差异有显著性（F=35.06，P＜0.05），其中与A组相比，C组细胞骨架表面积显著增加（P＜0.05）。见表2、图1A～C。

2.3 D～G组小鼠心肌细胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达水平及细胞骨架表面积比较

RT-qPCR技术检测结果显示，D～G组细胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达水平差异有显著性（F=117.60～572.30，P＜0.05）；与E组相比，G组上述指标表达水平显著降低（P＜0.05）。罗丹明标记鬼笔环肽染色结果示，D～G组心肌细胞骨架表面积分别为（1.00±0.13）、（1.65±0.13）、（1.68±0.07）和（1.26±0.07）μm2，四组比较差异具有显著意义（F=48.05，P＜0.05），其中与E组相比，G组细胞的骨架表面积显著减小（P＜0.05）。见图1D～G、表3。

3 讨  论

我国目前是全球心血管疾病负担最重的国家之一[11]。由于现在人类生活方式的改变，心血管疾病流行情况也在发生变化，农村居民较城镇占比更高，发病人群也越来越年轻化[12]。心脏肥厚分为病理性肥厚和生理性肥厚，病理性肥厚多由高血压、心肌梗死、结构性心脏疾病等造成[13]，此时心肌肥大细胞中ANP、BNP、β-MHC表达水平会明显上调，细胞表面积变大[14]。然而，持续病理超负荷会引起心脏适应不良及重塑，导致心力衰竭[15]。目前对心肌肥大机制的研究还不够深入，因此对心肌肥大分子机制的研究具有重要意义。

近年来，新类别的非编码RNA正在逐渐被发现[16-17]。长期以来，tRNA被认为是参与蛋白质翻译过程的重要组分，其衍生片段tsRNA包括tiRNA和tRFs，参与细胞的增殖、分化、凋亡，以及基因的调控、转座子抑制等细胞生物学过程，从而影响疾病的发生发展[7，18-19]。tsRNA调节mRNA的失稳、翻译及逆转录和转录后过程。SHEN等[21]研究发现，tRF-5在异丙肾上腺素诱导的大鼠肥大心肌中高表达，而tRFs1和tRFs2的过表达则导致了心肌肥大标志物ANP、BNP、β-MHC基因的上调。在小鼠胚胎成纤维细胞中，过表达的tsRNA通过竞争性结合细胞色素C，可抑制成纤维细胞凋亡[20]。SHEN等[21]研究表明，tRFs在异丙肾上腺素诱导的大鼠心脏肥大中可能参与了心肌肥大的代际遗传，且tRFs对于心肌肥大的影响在大鼠后代中更加明显。低蛋白饮食小鼠父系睾丸生殖细胞中活性氧的产生增加，可通过激活ATF7和H3K9me2的表达调节tsRNA转录[22]。有研究也发现，应激反应条件（如氧化应激、缺氧、衰老和代谢紊乱等等）可诱导人及小鼠心肌组织中tsRNA异常表达[23-25]。在心脏肥大、心肌缺血、动脉粥样硬化、静脉曲张和肺动脉高压等疾病中，心脏组织tsRNA表达水平均发生变化[9]。根据特定类型tsRNA在心血管疾病发生发展中发挥的积极或消极作用，tsRNA可能为该类疾病新型治疗靶点或特定生物标志物的研究提供新思路。但是目前心血管疾病中的tsRNA的作用靶点、结合位点、诱导剂和调节因子仍不清楚，其结合方式、修饰类型、作用机制更是知之甚少。

本研究前期实验发现，3′tRF-PheGAA在AngⅡ诱导的小鼠乳鼠心肌肥大细胞中表达明显上调，并且心肌细胞比成纤维细胞中的表达水平更高。本研究通过表达以及抑制小鼠乳鼠原代心肌细胞的3′tRF-PheGAA，通过检测心肌细胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC mRNA表达水平及测量心肌细胞骨架表面积大小等指标，探讨心肌细胞肥大与3′tRF-PheGAA表达的关系。研究结果显示，C组心肌细胞中3′tRF-PheGAA表达明显上调，心肌细胞肥大指标ANP、BNP、β-MHC mRNA也明显上调，且C组心肌细胞骨架表面积较A组表面积明显增大，表明过表达3′tRF-PheGAA可诱导小鼠乳鼠心肌细胞肥大。在D～G组中，G组心肌细胞中3′tRF-PheGAA表达相较于E组明显下调，心肌肥大指标ANP、BNP、β-MHC mRNA也明显下调，细胞骨架表面积相较于E、F组则明显减小，表明抑制3′tRF-PheGAA表达可缓解AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

综上所述，抑制小鼠乳鼠原代心肌细胞当中的3′tRF-PheGAA表达能够缓解AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，3′tRF-PheGAA可能是潜在的治疗心肌细胞肥大的靶点，但其具体分子机制还有待后续深入研究。

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学实验动物福利伦理委员会的审核批准（文件号20220220-C579020230725017）。所有实验过程均遵照《青岛大学动物福利伦理守则》的条例进行。

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