Ghrelin基因敲除对小鼠黑质区多巴胺能神经元突触后电位的影响

刘静 李焕焕 焦倩 陈曦 姜宏 杜希恂

［摘要］ 目的

探讨胃饥饿素（ghrelin）基因敲除对小鼠黑质多巴胺能神经元突触后电位的影响。

方法 分别选取10周龄雄性ghrelin基因敲除小鼠（ghrelin-/-组）及其同窝雄性野生型（WT）小鼠（WT组）的黑质组织，采用转录组学测序（RNA-seq）技术筛选差异表达基因（DEGs），通过KEGG通路富集分析DEGs可能参与的神经元突触活动相关信号通路，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法对筛选出的DEGs进行验证，并应用蛋白免疫印迹（Western blotting）方法检测神经元突触活动相关基因的蛋白表达情况。

结果 与WT组相比，ghrelin-/-组小鼠多巴胺能神经元突触传递信号通路上的23个基因水平发生了显著性变化，其中谷氨酸促离子型受体α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸型亚基3（GluA3）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）分别调控神经元突触后膜上的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体和N-甲基-D-天冬氨酸受体；在ghrelin-/-组小鼠黑质组织中，GluA3和GSK-3β基因表达出现明显的下调。RT-qPCR方法检测结果显示，与WT组相比，ghrelin-/-组小鼠黑质组织当中GluA3和GSK-3β mRNA水平明显下调（t=2.408、2.740，P<0.05）。Western blotting方法检测结果显示，与WT组相比，ghrelin-/-组小鼠黑质组织中GluA3蛋白的表达水平明显上调（t=2.530，P<0.05），GSK-3β蛋白的表达明显下调（t=3.469，P<0.05）。

结论 Ghrelin基因敲除可能通过使小鼠黑质多巴胺能神经元突触后电位长时程增强，从而增强兴奋性突触传递活动，参与运动调控。

［关键词］ 胃促生长素；基因敲除技术；黑质；多巴胺能神经元；长时程增强；受体，离子型谷氨酸

［中图分类号］ R338.1;R394    ［文献标志码］ A

胃饥饿素（ghrelin）是一种胃底X/A样细胞分泌的含28个氨基酸的脑肠肽，是生长激素促分泌素受体1a（GHS-R1a）的内源性配体，可刺激人和动物生长激素的分泌[1-4]。Ghrelin在机体中发挥着重要的生理学功能，如刺激肠道蠕动、调节压力和焦虑、防止肌肉萎缩以及改善心血管功能等[5-7]。本实验室前期研究发现，外源性ghrelin可通过激活GHS-R1a介导的信号转导通路，拮抗神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的小鼠黑质多巴胺能神经元损伤，发挥神经保护作用[8-11]。Ghrelin通过调节中枢神经回路，如下丘脑、腹侧被盖和海马回路的突触可塑性，使机体对摄食、药物成瘾、学习记忆等方面做出反应[12]。本研究拟选用雄性野生型（WT）小鼠和雄性ghrelin基因敲除小鼠，对其黑质进行转录组学测序（RNA-seq），筛选差异表达基因（DEGs），通过KEGG通路富集分析DEGs可能参与的神经元突触活动相关信号通路，并验证富集在神经元突触活动通路上的相关基因以及蛋白在黑质中的表达情况，探讨ghrelin对小鼠黑质多巴胺能神经元突触活动的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TRIzol、RT SuperMix for qPCR、SYBR qPCR预混液购买于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，BCA蛋白定量试剂盒购买于北京康为世纪有限公司，GSK-3β抗体购自杭州华安生物技术有限公司，GluA3抗体购自武汉爱博泰克生物公司，ECL发光液购自德国Millipore公司，UVP BioDoc-It成像系统购自美国Upland公司，SDS-PAFE垂直凝胶电泳槽、S1000 PCR仪、CFX96TM Real-Time System购自美国BIO-RAD公司。

1.2 实验动物与分组

10周龄的雄性ghrelin基因敲除小鼠（ghrelin-/-组）11只及同窝雄性WT小鼠（WT组）11只均由江苏集萃药康生物公司提供。所有小鼠在室温（24±1）℃，湿度为（55±5）%条件下饲养，自由进食饮水。

1.3 方法

1.3.1 黑质组织的提取及RNA-seq分析 所有ghrelin-/-组和WT组小鼠麻醉后，迅速断头处死，取出脑组织，置于干冰中速冻3 min，剥离双侧黑质组织并置于标记好的EP管中，－80 ℃保存。每组随机选取6只小鼠的双侧黑质组织用于测序。测序样本低温运输至北京诺禾致源生物有限公司进行RNA-seq分析。

1.3.2 DEGs筛选 采用标准方法提取WT组和ghrelin-/-组小鼠脑组织中RNA，采用Subread软件对基因表达水平进行定量分析，筛选两组小鼠黑质组织的DEGs，筛选条件为P<0.05。

1.3.3 KEGG通路富集分析 采用Cluster Profiler软件对DEGs进行KEGG通路富集分析，以P<0.05为显著富集，P值越小表示富集越显著，选取P值较小且参与突触电活动通路的基因，用于后续小鼠的验证。

1.3.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测小鼠黑质区α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸型亚基3（GluA3）、糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）mRNA的水平 将两组小鼠剩余的双侧黑质组织（每组各5只），取其一侧的全部黑质组织置于500 μL TRI-

zol中，应用TRIzol法提取组织总RNA。以样本中提取的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成互补的cDNA。配置PCR反应体系，经过40个循环完成扩增。引物由北京擎科生物股份有限公司合成，引物名称及其序列见表1。采用SYBR法定量检测目的基因GluA3、GSK-3β以及内参基因GAPDH的表达水平，根据2－△△CT法计算目的基因的相对表达水平。

1.3.5 Western blotting法检测小鼠黑质区GluA3、

GSK-3β蛋白的表达水平 取两组小鼠剩余的另外一侧黑质组织，加入100 μL蛋白裂解液（蛋白磷酸酶抑制剂∶蛋白酶抑制剂∶RIPA强裂解液=1∶2∶100）充分研磨以后，冰上静置30 min，4 ℃下12 000 r/

min离心20 min。上清液移至新EP管中， BCA法测定蛋白浓度。蛋白经SDS-PAGE电泳（浓缩胶电泳参数为恒压80 V，分离胶电泳参数为恒压120 V）后湿转至PVDF膜上，将膜从湿转盒中取出，加入TBST配置的10%脱脂奶粉中，室温孵育2 h。再分别加入GluA3（1∶1 000）、GSK-3β（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃下于摇床上过夜。将HRP偶联的二抗用TBST按照1∶10 000比例进行稀释，室温下孵育2 h。用UVP BioDoc-It成像系统以及ECL高灵敏化学发光液试剂盒显影，并采用Image J软件进行灰度值分析，GluA3、GSK-3β蛋白相对表达量以GluA3、GSK-3β

2 结  果

2.1 数据质量评估

12只小鼠的测序错误率均低于12.5%，GC含量分布稳定，WT组与ghrelin-/-组间基因表达量的Pearson相关系数均大于0.93，说明数据的可靠性高，基因相似性高，可进行后续分析。

2.2 两组小鼠黑质组织中DEGs分析

WT组与ghrelin-/-组间共有2 355个DEGs，其中1 655个基因在WT组呈现高表达，700个基因在ghrelin-/-组呈现高表达。

2.3 两组小鼠黑质组织中DEGs的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析结果显示，有23个DEGs富集到多巴胺能突触信号通路上，与WT组相比，ghrelin-/-组中表达上调的基因有5个，分别为原癌基因（Fos）、G 蛋白亚基γ3（Gng3）、蛋白磷酸酶1催化亚基α（Ppp1ca）以及蛋白磷酸酶2催化亚基（Ppp2r3a、Ppp2r5e）；表达下调的基因有18个，有多巴胺受体的D3亚型（Drd3）、钠电压门控通道α亚基1（Scn1α）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、cAMP反应元件结合蛋白1（Creb1）、谷氨酸离子型受体AMPA型亚基（GluA3、GluA4）、NMDA受体NR2亚基（Grin2b、Grin2a）、钙电压门控通道亚基（Cacna1a、Cacna1d）、丝氨酸/苏氨酸激酶3（Akt3）等。其中GluA3和GSK-3β分别调节α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异[FK（W][XCzz5.tif][FK）]唑丙酸受体（AMPAR）和N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）的活性，在突触传递过程中发挥着重要的生理功能。

2.4 Ghrelin基因敲除对小鼠黑质组织中GluA3、GSK-3β mRNA表达的影响

RT-qPCR结果显示，WT组小鼠黑质组织中GluA3 mRNA水平为1.129±0.230，ghrelin-/-组为0.552±0.068，两组比较差异具有显著意义（t=2.408，P<0.05）；WT组小鼠黑质组织中GSK-3β mRNA的水平为1.257±0.121，ghrelin-/-组则为0.921±0.089，两组比较差异具有显著性（t=2.740，P<0.05）。

2.5 Ghrelin基因敲除对小鼠黑质组织中GluA3、GSK-3β蛋白表达的影响

WT组小鼠黑质组织中GluA3蛋白表达水平为0.141±0.012，ghrelin-/-组为0.290±0.058，两组比较差异具有显著性（t=2.530，P<0.05）；WT组小鼠的黑质组织中GSK-3β蛋白的表达水平为0.670±0.056，ghrelin-/-组为0.422±0.040，两组比较差异具有显著性（t=3.469，P<0.05）。见图1。

3 讨  论

突触后电位持续增强或减弱的现象称为长时程增强（LTP）或长时程抑制（LTD），LTP和LTD的改变都会导致神经系统疾病的发生，如帕金森病、阿尔茨海默病、神经性疼痛、抑郁症等[13]。在中枢神经系统中，兴奋性神经传递主要是由谷氨酸及其离子型受体介导的，包括介导中枢神经系统快速兴奋性突触传递的AMPAR和维持长期突触可塑性的NMDAR。在哺乳动物中，AMPAR主要负责大脑中的兴奋性突触传递，由成孔亚基GluA1～GluA4的各种组合形式组成[14-16]。在小鼠海马CA1锥体神经元中，表达有GluA3亚基的AMPAR存在于突触和细胞表面，基础条件下，GluA3处于低电导状态，当细胞内cAMP水平升高时，GluA3介导的电流会显著增加[14]。AMPAR激活后，GluA3亚基能引起大量的Na＋和Ca2＋由胞外流到胞内，从而介导中枢神经系统的兴奋性突触传递。研究表明，创伤性脑损伤后小鼠海马区GluA3的表达水平上调，该蛋白的上调能够引起神经元损伤以及学习和记忆功能的下降甚至丧失[17]。本研究结果显示，与WT组小鼠相比，ghrelin-/-组小鼠黑质组织中GluA3的mRNA水平降低，但是GluA3蛋白表达水平显著升高，这种现象通常称为mRNA和蛋白质水平之间的解偶联。翻译和翻译后修饰以及mRNA结合蛋白和非编码RNA都可导致mRNA和蛋白质表达水平的差异，另外蛋白降解的途径被抑制也会导致这一现象[18-19]。而上调的GluA3蛋白通过引起突触后膜Na＋和Ca2＋的内流，从而引发兴奋性突触传递[17，20]。

GSK-3是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化调节糖原合酶的活性，在中枢神经系统中大量表达。该酶具有两种形式，即GSK-3α和GSK-3β，体内研究表明GSK-3α基因缺失对小鼠胚胎存活没有显著影响，但GSK-3β的完全敲除能够引发小鼠胚胎死亡[21]。GSK-3β功能异常与各种疾病有关，包括阿尔茨海默病、抑郁症、双相情感障碍和药物成瘾等。因此，GSK-3β被认为是多种脑部疾病的主要治疗靶点。该激酶被证实可参与NMDAR依赖性LTP和LTD的调节。研究表明，GSK-3抑制剂能够阻止大鼠海马CA1神经元LTD的诱导，且可挽救因GSK-3β过表达而引起的LTP损伤。因此GSK-3β是诱导大鼠海马CA1神经元LTD所必需的，在LTD期间被激活[22]；大鼠海马中的LTP被诱导以后，GSK-3β受到抑制[23-24]。在本研究中，与WT组小鼠相比，ghrelin-/-组小鼠黑质中GSK-3β mRNA和蛋白表达水平均明显降低，这进一步提示ghrelin敲除后，可能会引起小鼠NMDAR依赖性LTP增加。

综上所述，在ghrelin基因敲除小鼠中，中脑黑质区GluA3蛋白表达水平增加，GSK-3β蛋白表达水平降低，这可能会引起多巴胺能神经元AMPAR以及NMDAR介导的LTP的发生，从而增强兴奋性突触传递活动。本研究结果为ghrelin在神经元突触调控中的研究提供了一定的实验依据。

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学医学伦理委员会的审核批准（文件号QDU-AEC-2023135）。所有实验过程均遵照《青岛大学实验动物操作标准》的条例进行。

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