姜黄素对帕金森病模型小鼠的神经保护作用及其机制

王子怡 毛华 金婷婷 张香凝 韩帅 梁永新

［摘要］ 目的

探究姜黄素对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的帕金森病（Parkinson disease，PD）模型小鼠的神经保护作用及其机制。

方法 将72只雄性C57BL/6J小鼠，随机分为Control组（A组）、MPTP组（B组）和MPTP＋姜黄素组（C组）。实验前5 d，B、C组小鼠每天腹腔注射MPTP 30 mg/kg，A组小鼠腹腔注射等量生理盐水；第6天始，C组小鼠每天腹腔注射姜黄素（溶于DMSO）50 mg/kg，A、B组小鼠每天腹腔注射等量的DMSO，连续7 d。给药结束后，采用行为学实验评估各组小鼠的运动、学习和记忆力功能。实验第15天，取各组小鼠黑质区，ELISA法检测TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，蛋白印迹法检测CD86和NF-κB的相对含量，荧光免疫组织化学染色检测TH阳性神经元的数量。

结果 与B组相比，A、C组小鼠的下降时间明显减少，脱落潜伏期和交替百分比明显增加（F=17.29～19.28，P<0.05），黑质中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明显减少（F=31.73～80.97，P<0.05），黑质中CD86、NF-κB蛋白的表达明显减少（F=24.93、55.61，P<0.05），黑质中TH阳性神经元的数量显著增加（F=47.64，P<0.05）。

结论 姜黄素可有效改善PD模型小鼠的行为障碍，发挥神经保护作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路，致小胶质细胞活化抑制、炎性反应发生降低、多巴胺能神经元退化减轻有关。

［关键词］ 帕金森病；疾病模型，动物；姜黄素；小神经胶质细胞；NF-κB；神经炎症性疾病；神经保护

［中图分类号］ R742.5    ［文献标志码］ A

帕金森病（Parkinsons disease，PD）是一种常见的神经变性疾病。研究发现，PD患者黑质中存在神经炎症，当小胶质细胞过多分泌炎性因子时，易对多巴胺能神经元产生毒性，并最终致其发生进行性死亡[1-2]。因此通过干预降低黑质区促炎因子的水平，减缓PD患者神经炎症进展，是目前比较有效治疗措施之一。目前临床主要使用的一线药物有左旋多巴和多巴胺受体激动剂，但效果并不满意，长期服用患者可产生耐药性，甚至出现异动症、妄想和焦虑等不良反应[3]。姜黄素提取于姜黄的根茎，具有抗炎、抗氧化应激、抗凋亡等作用，而且毒副作用小[4-6]。本研究通过腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）构建PD模型小鼠，观察姜黄素对小鼠行为学习和记忆功能的影响，并进一步探究其作用机制，为PD患者的临床治疗提供实验数据参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

姜黄素购于美国Sigma公司，小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒均购于上海江莱生物有限公司，MPTP购于美国GLPBIO公司，兔抗CD86抗体、兔抗p-NF-κB p65抗体和GAPDH均购买于英国Abcam公司，抗酪氨酸羟化酶抗体购于美国CST公司。转棒测试仪和Y迷宫全自动测试仪购于美国Med Associates公司。

1.2 动物分组与处理

健康成年雄性C57BL/6J小鼠72只购自斯贝福（北京）生物有限公司（No.11032422010540776-5），随机分为Control组（A组）、MPTP组（B组）和MPTP＋姜黄素组（C组），每组24只。实验前5 d，B、C组小鼠每天腹腔注射MPTP 30 mg/kg，A组小鼠腹腔注射等量生理盐水；第6天始，C组小鼠腹腔注射姜黄素（溶于DMSO）50 mg/kg，A、B组小鼠每天腹腔注射等量的DMSO，连续7 d[7]。

1.3 行为学实验评估各组小鼠的运动、学习和记忆功能

1.3.1 爬杆实验[8] 实验第13天时，分别从各组小鼠中随机选取8只，置于表面粗糙木杆顶部（直径8 mm、高55 cm），测量小鼠自顶部至前爪到达地面的时间（下降时间）。每只小鼠隔30 min测量一次，连续测试3次，结果取平均值。每次实验结束后均将小鼠放回。

1.3.2 转棒实验[9] 爬杆实验结束后，间隔6 h，分别从各组中再随机选取8只小鼠进行转棒实验。将各组小鼠放置于转棒测试仪的转棒上，从4 r/min到40 r/min匀速调节转棒的速度，记录脱落潜伏期（小鼠从转棒上掉落的时间）。每只小鼠测试3次，每次测试的间隔时间大于30 min，结果取均值。每次实验结束后均将小鼠放回。

1.3.3 Y迷宫实验[8] 实验第14天时，分别从各组中再随机选取8只小鼠进行Y迷宫实验。将各组小鼠放置在Y迷宫全自动测试仪的一臂末端，并允许其在每个臂上自由爬行。记录小鼠8 min内入臂次数（当小鼠的后爪完全进入其余任何手臂时，认为完成一次入臂过程）和自发交替次数（小鼠依次进入不同臂认为完成一次交替）。交替百分比=[（自发交替次数）/（入臂次数－2）]×100%。

1.4 ELISA法检测各组小鼠黑质中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量

实验第15天时，将每组24只小鼠随机分为3份，每份8只。随机取其中的一份8只小鼠，以异氟烷吸入麻醉后处死，剥离出小鼠脑组织，用浓度0.01 mol/L的PBS（pH 7.4）冲洗后，分离出黑质并测量其质量后，按照1∶9比例（1 g脑组织对应0.01 mol/L的PBS 9 mL）加入PBS溶液，置于冰上充分研磨、离心后，收集上清液。按照ELISA试剂盒的说明检测黑质中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.5 蛋白印迹法检测各组小鼠黑质中CD86以及NF-κB的相对含量

再随机取其中的一份8只小鼠，以异氟烷吸入麻醉后处死，剥离出脑组织，用浓度0.01 mol/L的PBS（pH 7.4）冲洗后，分离出黑质并测量其质量后，取20 mg的黑质组织依次加入400 μL的RIPA裂解液、4 μL 蛋白酶抑制剂和4 μL colktail后，置于冰上充分研磨、离心后，收集上清液。提取黑质的蛋白样本，样本经过电泳、转膜、封闭等操作后，分别与一抗抗CD86（1∶1 000）、抗p-NF-κB p65（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶5 000）在4 ℃下孵育过夜。TBST冲洗3次后，将膜分别与相应的二抗（1∶5 000）在37 ℃下孵育2 h。TBST冲洗3次后显影，以Image J软件分析条带灰度值。

1.6 荧光免疫组织化学染色检测各组小鼠黑质中TH阳性神经元数量

剩余的一份8只小鼠，以异氟烷吸入麻醉后处死，将脑组织经过剥离、固定、脱水等操作后。参考小鼠脑图谱[10]，将其沿冠状面以10 μm厚进行切片。选择其中含有黑质组织的切片，经过冲洗、通透以及封闭等操作后。用抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体（1∶200）孵育切片并于4 ℃下过夜。第2天用0.01 mol/L的PBS冲洗切片3次，共计15 min，以荧光二抗（绿色，1∶100）在室温下孵育1 h。用BX53荧光显微镜和DP50数码相机观察并拍摄黑质中TH阳性神经元数目。

2 结  果

2.1 姜黄素对各组小鼠运动、学习以及记忆功能的影响

三组小鼠的下降时间、脱离潜伏期、交替百分比比较差异有显著性（F=17.29～19.28，P<0.05），各组间两两比较，差异也均具有显著意义（P<0.05）。见表1。

2.2 姜黄素对各组小鼠黑质中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影响

三组小鼠黑质中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较差异均有显著性（F=31.73～80.97，P<0.05），各组间两两比较，差异也均具有显著意义（P<0.05）。见表2。

2.3 姜黄素对各组小鼠黑质中CD86和NF-κB表达的影响

蛋白印迹法检测结果显示，A～C组小鼠黑质中CD86蛋白的相对表达量分别为1.00±0.00、1.78±0.33、1.37±0.17，p-NF-κB p65蛋白的相对表达量分别为1.00±0.00、1.44±0.12、1.22±0.13。各组间上述指标比较差异均具有统计学意义（F=24.93、55.61，P<0.05），各组间两两比较，上述两个指标差异也均具有显著性（P<0.05）。见图1。

2.4 姜黄素对各组小鼠黑质中TH阳性神经元数量的影响

A～C组小鼠黑质中TH阳性神经元数目分别为（60.62±10.29）、（25.25±4.83）、（39.00±5.55）个，各组间比较差异有显著性（F=47.64，P<0.05），各组间两两比较，差异均具有显著意义（P<0.05）。见图2。

3 讨  论

PD是一种多因素导致的以黑质中多巴胺能神经元进行性死亡为特征的疾病。目前的治疗方案不能有效阻止或减缓PD的神经退行性病变[11]。因此，需要进一步探索PD发生发展的相关机制，并找寻有效的治疗药物。大量研究表明，神经炎症参与PD的病理生理过程。在PD患者的大脑中，均发现小胶质细胞的活化以及促炎因子的过度表达[12-14]。

姜黄素具有显著的抗炎、抗氧化以及抗癌的特性[15-17]。最近的一些研究指出，姜黄素在PD、阿尔兹海默症和多发性硬化等神经系统疾病中，具有神经保护作用[18-20]。另有研究显示，姜黄素可以通过抑制NLRP3炎症小体的活化，以及缓解Drp1介导的线粒体功能障碍，发挥对PD患者的神经保护作用[21]。本研究采用MPTP构建经典PD模型小鼠，通过爬杆实验、转棒实验和Y迷宫实验，对小鼠的运动、学习以及记忆功能进行测试，结果表明，与MPTP组小鼠相比，经姜黄素治疗的PD模型小鼠，下降时间缩短、脱离潜伏期增加和交替百分比提高。提示姜黄素可有效改善PD模型小鼠的运动、学习和记忆功能障碍。虽然目前已经有大量研究证实，姜黄素具有神经保护作用，然而姜黄素治疗PD的机制尚不清楚。

在本研究中，首先鉴定了姜黄素对促炎因子的影响，再进一步研究其对MPTP诱导的小鼠黑质中小胶质细胞的作用。ELISA法检测结果显示姜黄素能够减少黑质中TNF-α、IL-1β和IL-6的过度释放，验证了姜黄素对神经炎症的调控作用。蛋白印迹法结果表明，姜黄素可以抑制MPTP诱导的小鼠黑质中小胶质细胞表面标记物CD86的表达，表明姜黄素可以抑制小胶质细胞的活化。为了进一步探讨姜黄素调控小胶质细胞活性的分子机制，本研究还采用蛋白印迹法检测了小鼠黑质中NF-κB通路相关蛋白，发现姜黄素抑制了MPTP诱导的小鼠黑质中NF-κB通路相关蛋白的表达。以上结果表明姜黄素抑制小胶质细胞，减轻神经炎症可能通过调控细胞中NF-κB信号通路蛋白的表达来实现的。

研究表明，小胶质细胞可以促进神经炎症的发生发展。在黑质中可使多巴胺能神经元发生退化，因此抑制黑质中小胶质细胞介导的神经炎症，也许可以作为一种治疗PD的方案[22]。小胶质细胞长期持续活化，会分泌如TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子。研究发现PD患者血清、黑质和脑脊液中的炎性因子浓度较正常人群明显升高。TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质。研究发现TNF-α主要由小胶质细胞产生，也能激活小胶质细胞产生IL-6等炎症因子，诱导黑质中多巴胺能神经元的渐进性丧失。IL介导了神经炎症的恶性循环过程，对炎症起主导作用。当过度激活IL-1β和IL-6时，就会引起胶质细胞活化并对神经元产生损伤[23]。此外，NF-κB是炎性细胞因子的关键转录因子。研究表明，NF-κB这一经典信号转导通路已被证明可以促进小胶质细胞介导的神经炎症，抑制NF-κB的活化可以改善小鼠的运动迟缓症状[24]。NF-κB的激活可增加小胶质细胞对IL-6和IL-1β等促炎因子的释放，并且在6-OHDA介导的PD动物模型中，NF-κB信号通路的活化参与黑质中多巴胺能神经元的死亡过程[25]。

TH代表黑质-纹状体通道的初始阶段。此通路为大脑中比较重要的多巴胺传递途径，因此TH在多巴胺合成中发挥不可或缺的作用。TH作为多巴胺能神经元标志物，其水平与多巴胺能神经元的活性有关。黑质中TH阳性神经元的表达随PD的发展进行性减少，也是PD进展的标志[26]。本研究中姜黄素治疗可显著抑制MPTP诱导的小鼠黑质中TH阳性神经元的减少。这些结果证实姜黄素对PD具有显著的神经保护作用。

综上所述，姜黄素可有效改善PD模型小鼠的运动、学习、记忆障碍，降低黑质中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，抑制黑质中小胶质细胞活化，减缓黑质中多巴胺能神经元退化，从而发挥神经保护作用，其机制或与抑制NF-κB信号通路相关。本研究为姜黄素应用于PD治疗提供了理论和实验支持。

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学医学部伦理委员会的审核批准（文件号QDU-AEC-2023116）。所有实验过程均遵照《实验动物管理条例》进行。

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