镉对克氏原螯虾的急性毒性作用研究

2024-07-03李纪春刘慧圆杨吉柯王一帆游辉钟瑶李帅东车丽涛杨雅茹

江西水产科技 2024年3期

李纪春刘慧圆杨吉柯王一帆游辉钟瑶李帅东车丽涛杨雅茹

摘要：采用静水水生生物毒性试验法，研究重金属镉对克氏原螯虾的影响。克氏原螯虾对重金属镉会产生较强的急性毒性效应，通过probit过程分析得出6 h、12 h、24 h、48 h的LC50分别为：177.699 mg/L、80.706 mg/L、32.281 mg/L、26.350 mg/L，LC50与时间存在着紧密关系，LC50随着暴露时间的变化而变化，时间越久LC50值越低；安全质量浓度为5.267 mg/L，是我国渔业水质标准的1053.4倍；水体中镉为10 mg/L时，克氏原螯虾肝胰腺组织和肌肉组织中镉含量分别为3.09 mg/L、0.173 mg/L，严重超出我国农产品食品限定标准0.005 mg/L；镉为83 mg/L时，克氏原螯虾的肝胰腺组织形态结构表现出异常，并在24 h小龙虾全部致死。结果表明，克氏原螯虾对重金属镉具有较强的耐受力和抵抗能力。

关键词：克氏原螯虾；重金属镉；急性毒性

中图分类号：S945 X174 文献标识码：A

基金项目：2022年国家级大学生创新创业训练计划项目（202210641034）；四川省科技计划重点研发项目（23ZDYF3050）；宜宾职业技术学院自然科学重点项目（ZRKY21ZD-01）

作者简介：李纪春（2000—），男，四川广安人，本科，研究方向为动物生产与环境控制。

通讯作者：杨雅茹（1989—），女，四川宜宾人，硕士研究生，讲师，研究方向为动物生产与环境控制。

随着工业城市化的进程，城镇生活垃圾污水不合理处置、金属工业的产生和开发利用的废水、农业活动生产以及含镉气体的产生等［1］，重金属镉对水环境的污染日益严重。广泛存在于水体环境中的重金属镉，作为其主要污染物之一，对大部分的水生生物造成了严重的危害［2］。水生生物通过浸透、呼吸、消化、吸收等途径对水体中暴露的重金属镉进行富集，生物体内富集的镉毒性强、代谢半衰期长，其半衰期和代谢半衰期为10～30 a和4～19 a。生物体难以分解和利用镉，镉不断地在体内进行蓄积，在生物法则的食物链作用下，高一级的生物体内的重金属镉不断蓄积［3］，从而对人类的生命健康构成巨大威胁。

克氏原螯虾（Procambarus clarkii），又俗称小龙虾，是我国最大淡水经济水产养殖物种之一，其营养价值含量高，肉质紧致鲜美，对于广大消费者来说是深夜美食的灵魂，在夜经济当中长期占据重要地位，受到水产养殖者的广泛投产。据《中国小龙虾产业发展报告（2022）》［4］，2021年，我国淡水小龙虾在经济动物养殖类中位居第六，其总体养殖面积和产量达2600万×667 m2和263.36万t，较2019年分别增长19.01%和10.02%，生产总值达4221.95亿元，同比增长22.43%。国内外对克氏原螯虾成年雄虾的急性毒性研究甚少，而研究其急性毒性试验，可以对克氏原螯虾的养殖水体最低安全质量浓度的指标制定和大田生产应用提供可靠的科学试验数据依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组

克氏原螯虾选自宜宾海德水产科技有限公司在南溪区养殖基地的成年雄虾，平均体重（22.99±1.01）g，平均体长（8.69±0.16）cm。在实验室的养殖池内暂养3天，暂养期间连续供氧，不换水，每日18：00时正常投喂原始饲料，死亡率低于40%。预试验和正式试验开始前一天停止饲喂饲料，然后随机选取四肢健全，灵敏度高，强健有力，活泼好动的虾作为试验用虾。试验分组虾数为每组20尾，每组3个重复。

1.2 试验条件

试验在实验室进行，时间为2022年7月至10月。养殖池规格为550 mm×450 mm×300 mm（长×宽×高），试验用水为160 L白色塑胶水桶在阳光下充分曝气2 d后的实验室自来水，试验环境温度采用美的空调调控，实验室温度为（21.73±1.73）℃，养殖水体温度为（18.99±1.53）℃。

1.3 试验仪器与试剂

重金属镉采用北京有色金属研究总院生产的国家标准样品GSB04-1721-2004单元素标准溶液硝酸镉［Cd（NO3）2］，每组所需浓度以此为原液进行稀释使用，其余使用仪器和试剂见表1和表2。

1.4 试验方法

按照水生动物毒理学试验方法开展预实验［5］，按等比间距设置水体浓度区间，找到水体镉离子对成体雄性克氏原螯虾的24 h全死亡和48 h全存活浓度。再根据水体浓度区间上下限按等对数间距设置浓度梯度开展正式实验，设置4个浓度梯度，分别为：10 mg/L、33 mg/L、63 mg/L和83 mg/L，再设置一个空白对照组，每个水体镉浓度设置3个平行组。因成体易区分性别，每组放克氏原螯虾成体雄性20只，各加入6 L相应浓度的溶液。试验开始后不充气、不换水、不投喂，6 h、12 h、24 h和48 h观察克氏原螯虾的中毒状态，统计死亡虾体数量并直接取出死亡克氏原螯虾，检测对照组和24 h全致死浓度的死亡虾体的组织病理学指标以及对照组和48 h全存活浓度中的小龙虾镉富集情况，同时计算所有试验组的平均死亡数量。死亡判断标准为：沉于底部，碰触身体5 min不动。

1.5 重金属镉测定

将养殖对照组和48 h全存活浓度中的小龙虾随机取样（每个重复随机2只），解剖腹部肌肉、肝胰腺，采用0.9%生理盐水进行轻度冲洗，再用吸水纸吸干水分，装入5 mL移液管-18℃冻藏，送往成都汇标检测技术有限公司，参照GB 5009.268-2016第一法（定量限为0.005 mg/kg），采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）进行镉测定。

1.6 组织形态观察

为了观察对照组和24 h全致死的小龙虾肝胰腺的组织病理学变化，制作HE染色切片进行显微观察。将解剖的新鲜小龙虾肝胰腺采用0.9%生理盐水进行轻度冲洗，再用吸水纸吸干水分，放入5 mL的离心管中并加入福尔马林溶液完全浸入，在低温4℃下保存，送至上海郑核生物科技有限公司进行石蜡切片制作，然后进行组织学观察。

1.7 数据分析与处理

用SPSS 28.0分析软件处理数据，结果为平均值±标准差。

镉胁迫急性毒性试验建立概率单位-质量浓度的直线回归方程，估算镉对克氏原螯虾6 h、12 h、24 h和48 h半致死浓度（LC50）及95%置信区间。镉对克氏原螯虾的安全浓度（Sc）公式（1）为［6］：

SC=48 h LC50×0.324 h LC5048 h LC502（1）

多组数据的统计方法采用单因素方差分析（one-way ANOVA）法，当差异显著时，采用Duncans法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 中毒症状

试验期间，镉溶液质量较高组（≥33 mg/L）中的小龙虾在刚放入试验溶液时均出现四处窜游，敏感性大，躁动不安，而镉溶液质量较低组（≤33 mg/L）中小龙虾的活动现象与对照组相似，在水体中静伏或者缓慢地游走。各组小龙虾随着时间不断延长，小龙虾的活动现象趋于缓慢和平静，在暂养池内对外界刺激反应表现迟缓，有的开始出现侧翻或者仰翻状态，口吐黄色体内物质（见图1），最后慢慢沉浮水底，直至死亡。生物体中含有一定的金属巯蛋白，与一定的金属离子结合在一定范围内起到解毒作用，一旦超过解毒范围，体内不断蓄积的重金属离子就会转移到生物体内的肝肾中影响代谢，并与其体内的生物大分子如酶、核酸等相互作用下，从而导致器官损伤及致命［7］。而各组小龙虾的死亡率随着时间的延长而明显不断地增高。较高质量浓度组（≥33 mg/L）小龙虾中毒死亡状态中，在前期，部分死亡体态呈侧卧卷曲状，中期时，出现静伏水底或者仰翻水体中的死亡状态，在经过更长时间的观察发现，小龙虾的尾部、肌肉部、足节肢以及头内容物被残食殆尽。

2.2 急性毒性效应

由表1可知，小龙虾的毒性效应随着镉溶液的浓度与作用的变化而存在差异，当小龙虾在镉浓度为10 mg/L时48 h的死亡率为0，而镉浓度＞33 mg/L时，小龙虾在48 h的死亡率达80%以上，在镉浓度为83 mg/L时小龙虾在24 h全部死亡；表明小龙虾在镉污染环境中存在着一定较强的耐受力，对镉浓度的增加有一定的敏感性，在高镉浓度下的敏感性明显较高，毒性更大。

对不同质量浓度组的急性毒性死亡小龙虾数据进行数据处理后，得到概率单位-质量浓度的直线回归方程，并对其相关性系数和回归显著性进行检验。由表2可知，小龙虾对不同浓度重金属镉的耐受性不同，小龙虾在6 h、12 h、24 h、48 h的死亡率与不同浓度的变化呈极显著性相关，在一定时间内小龙虾死亡率随着重金属镉的浓度增加而增加。对表1的过程数据进行统计分析，通过probit过程分析得出6 h、12 h、24 h、48 h的LC50分别为：177.699 mg/L、80.706 mg/L、32.281 mg/L、26.350 mg/L，LC50与时间存在着紧密关系，LC50随着暴露时间的变化而变化，时间越久LC50值越低。采用公式计算得出安全质量浓度为：5.267 mg/L，参照我国渔业水质标准限定量0.005 mg/L［8］，镉对小龙虾的安全质量浓度超出1053.4倍，表明小龙虾对镉污染的耐受能力很强。根据谭树华等［9］文中参照的毒性分级标准：LC50＜1 mg/L为剧毒，1～100 mg/L为高毒，100～1000 mg/L为中等毒性，1000～10000 mg/L为低毒，＞10000 mg/L为微毒或无毒，48 h LC50镉对小龙虾毒性为高毒。

2.3 组织中重金属镉含量

对镉暴露浓度为10 mg/L环境中小龙虾在48 h的肝胰腺组织和肌肉组织进行镉蓄积浓度测定，并与对照组进行对比。由表3可知，B组（10 mg/L）小龙虾肝胰腺组织和肌肉组织中镉含量分别为3.09 mg/L、0.173 mg/L，A组（对照组）小龙虾肝胰腺组织和肌肉组织中镉含量分别为0.924 mg/L、0.0207 mg/L；与A组（对照组）进行对比，B组的镉含量显著升高，严重超出我国农产品食品限定标准0.005 mg/L。结果表明小龙虾在镉暴露环境中有较强的蓄积能力和耐受力，并且肝胰腺组织的蓄积能力大于肌肉组织的蓄积能力。

2.4 组织形态学观察

由24 h的E组（83 mg/L）和A组（对照组）的小龙虾的肝胰腺组织的HE染色切片图像得知，A组（对照组）小龙虾肝胰腺组织的形态学结构正常，其小管结构完整无损伤，管腔呈空型星结构，相邻细胞组织结构紧密；E组（83 mg/L）的肝胰腺组织形态结构表现出异常，小管结构退化，管腔扩张势空化，肝细胞呈空泡样病变。结果表明，小龙虾蓄积在肝脏的镉对其组织形态结构有严重的损伤，肝胰腺组织是小龙虾储存营养物质的重要场所［10］，从而导致小龙虾的肝胰腺机能改变影响相关酶活性及解毒代谢能力等，最后死亡。图2为虾的肝脏HE切片形态，B细胞为分泌细胞（黑色箭头），E细胞为胚胎细胞（黄色箭头），可见肝脏小管（红色箭头），小管间可见基底膜（蓝色箭头）分割，并见肝脏管腔（绿色箭头）。

3 讨论

3.1 镉暴露对克氏原螯虾的急性毒性效应

不同的甲壳类、鱼类等水生生物对重金属镉的敏感性不同，且镉暴露对不同水生生物的急性毒性效应也存在明显差异。甲壳类水生生物克氏原螯虾对镉有较强的耐受力，宋维彦等［11］通过对幼体克氏原螯虾进行重金属镉急性毒性试验得出，在24 h、48 h、96 h的LC50浓度为36.99 mg/L、8.31 mg/L、4.22 mg/L，与高淑英等［12］对幼体日本对虾进行镉急性毒性试验中24 h、48 h、96 h的LC50浓度为1.616 mg/L、0.887 mg/L、0.303 mg/L进行相比，幼体克氏原螯虾是幼体日本对虾相同时间LC50含量的10倍左右。欧小兵等［13］研究水螅在24 h、48 h、72 h、96 h的LC50含量为0.002 mg/L、0.001 mg/L、0.000 mg/L、0.000 mg/L；江敏等［14］在24 h、48 h、72 h、96 h对罗氏沼虾仔虾进行镉毒性研究，相应LC50含量为0.032 mg/L、0.022 mg/L、0.015 mg/L、0.015 mg/L；以及王桂燕等［15］和王琳等［16］对草鱼和栉孔扇贝幼贝进行镉毒性研究，24 h、48 h、72 h、96 h的LC50含量为40.020 mg/L、35.050 mg/L、28.990 mg/L、24.410 mg/L和4.480 mg/L、3.160 mg/L、2.250 mg/L、1.620 mg/L的研究与谭树华等［9］对克氏原螯虾在24 h、48 h、72 h、96 h研究的LC50含量1197.093 mg/L、142.065 mg/L、90.848 mg/L、82.637 mg/L的对比下发现，对镉暴露的敏感能力中腔肠类动物＞甲壳类动物＞鱼类动物，其中克氏原螯虾的抵抗重金属镉的能力最强。本文中成体克氏原螯虾急性毒性研究中48 h LC50含量为26.350 mg/L，远高于董兴学等［17］对幼体克氏原螯虾镉急性毒性研究的48 h LC50含量为1.371 mg/L；对比结果表明，克氏原螯虾的体积大小、活动状态、养殖环境、镉形态均会影响镉暴露的情况，成体克氏原螯虾比幼体克氏原螯虾排毒能力和抵抗能力都强。在成体克氏原螯虾镉暴露的急性毒性研究中，谭树华等［9］发现克氏原螯虾在高浓度（157、250 mg/L）组中48 h的死亡率超过60%，LC50值142.06 mg/L，低浓度（63 mg/L）组中死亡率只有20%，LC50值1197.09 mg/L，安全质量浓度为0.60 mg/L，本文研究结果与其对比发现，在试验结果和过程中存在差异，但结果趋势相同，本试验在镉暴露量较低情况下，死亡率和安全质量浓度均较高，原因可能是试验环境温度未采用精密恒温仪器、未提供充足恒定的溶解氧、水质软硬度不同、温度过高、镉离子含量高、养殖空间狭窄、养殖水体不足、pH含量未恒定和夏季季节原因等。

3.2 镉在克氏原螯虾不同组织中的含量及蓄积情况

镉是一种有毒有害的重金属元素，在水体中存在时间较长，容易被生物吸收并积累。镉可以影响克氏原螯虾的生长、发育、呼吸和免疫等方面。镉可以通过口器、鳃和肠道等多种途径被克氏原螯虾吸收［18］。小龙虾采食受重金属镉污染的饲料，镉进入消化道分布到各个器官蓄积，达到一定量时造成严重损伤，抑制生长发育［19］，口器摄食成为主要的镉富集途径。克氏原螯虾头部的口器对镉的摄入具有较高的选择性和亲和力。在克氏原螯虾体内，镉主要积累在肝、鳃和肌肉等组织中。并且，镉还可以进一步转运到卵巢、胃腺和消化腺等组织中。

长期受到镉污染的克氏原螯虾，其肝脏和鳃中的镉含量较高，而且随着暴露时间的延长，镉的积累也会逐渐增加。黄霞等［20］在克氏原螯虾体内发现重金属镉的残留规律，肝脏中的含量占整体最高，其次是鳃，最后依次是肌肉组织、尾部和虾足部组织。何志刚等［21］在泉州地区的小龙虾体内鳃、肝脏、肌肉和足部中分别测定出0.114 mg/kg、0.147 mg/kg、0.014 mg/kg、0.024 mg/kg的重金属镉。金璇等［22］研究发现小龙虾头部内的肝脏、鳃等器官对重金属具有蓄积能力，蓄积浓度比肌肉组织高。王青钦等［23］在贵州独山草种场对小龙虾体内重金属研究得出，六月，小龙虾肝脏和肌肉解剖测定重金属镉分别为（0.40±0.05）mg/kg和（0.29±0.03）mg/kg，肝脏中重金属镉含量明显高于肌肉组织。而张旭等［24］对贵州草海江家湾、西海码头、吴家岩头和喽啰山四个地区小龙虾各组织内的重金属镉测定得出其肌肉和肝脏平均含量为（0.09±0.01）mg/kg、（0.87±0.28）mg/kg。吴坤杰等［25］在信阳市的污水沟里面检测出克氏原螯虾体内含有0.42 mg/kg的镉。魏唯等［26］在养殖环境对小龙虾体内重金属的水平及分布影响研究中发现，小龙虾在富集镉污染的水体中吸收量随着时间变化缓慢增长，第6天时，体内的镉已蓄积了7.2832 mg/kg。

本文试验结果与上述学者试验趋同，表明各时期的克氏原螯虾在不同镉暴露污染环境下适应性强、应激低，环境中的克氏原螯虾采食含量较低的含镉食物，镉日益累积在虾体内；肝胰腺组织中的重金属镉含量是所有组织中最高的，肌肉的含量微少。近年来，小龙虾是人们美食餐桌上的佳肴，受到了众多消费者的青睐，然而小龙虾头部中的肝胰腺组织，俗称“虾黄”，可能镉污染严重，人们应多注重食品安全。根据营养健康报告和慢性疾病状况报告等［27-28］数据分析发现，我国成年人平均体重为61.8 kg、每日人均水产品摄入量为29.6 g［29］。同时参考隶属于联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）中的食品添加剂联合专家委员会（JECFA）和中国营养学会（CNS）制定的每周对重金属镉的耐受摄入量（PTWI）为0.000018 mg/（kg·d）［30-32］。因此，镉污染已经成为淡水生态系统中不可忽视的环境问题之一，需要引起广泛关注和重视，人们一旦采食污染超标的水产品等食物，均会造成健康危害。

3.3 重金属镉对克氏原螯虾组织的影响

镉在克氏原螯虾中主要以离子形式存在，并且可以通过多种途径被吸收和积累。在克氏原螯虾体内，镉首先被肝和鳃组织积累，然后再向其他组织转移，肝胰腺则为主要的营养储存器官。

镉对克氏原螯虾的毒理作用机制非常复杂。镉可以通过多种途径影响克氏原螯虾的生物学过程。首先，镉可以干扰克氏原螯虾的生理代谢过程。镉会影响克氏原螯虾的呼吸过程，并进一步影响其氧化磷酸化过程和产生ATP的效率。其次，镉还可以引起克氏原螯虾体内的氧化应激反应。镉作为自由基产生剂，可以促进细胞内的脂质过氧化和蛋白质氧化等反应，导致氧化应激反应的发生。另外，镉可以抑制克氏原螯虾的免疫功能，降低其对病原体的抵抗力［33］。

董学兴等［34］通过镉对克氏原螯虾的酶代谢影响研究发现，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性：肝胰腺组织＞肌肉组织，与吴晓敏［35］研究结果中不同镉浓度的酶活性变化趋势相同，随着镉浓度的升高，其活性先升高后降低，表明重金属镉对克氏原螯虾组织中的酶活性影响不同。克氏原螯虾受到重金属镉污染胁迫时，机体会产生适应机制，通过过氧化氢酶等物质将活性氧自由基去除，进一步保护机体不被有害物质损伤。谭树华等［36］研究了克氏原螯虾肝胰腺组织在镉不同污染浓度影响下谷胱甘肽、VC和谷胱甘肽过氧化物酶的变化，研究表明，谷胱甘肽过氧化物酶活性随着镉浓度的升高而先升高后降低，但是，VC在趋势后的胁迫中表现出一定程度的恢复性，而始终被诱导的谷胱甘肽在镉浓度升高的影响下没有明显变化。本文中肝胰腺细胞组织空泡样病变，小管结构退化，功能减退，从而导致过氧化氢酶等活性降低，无法清除活性氧自由基，使克氏原螯虾的解毒机制无法产生，抗氧化酶结构改变，对氧化酶和活性氧自由基的氧化没有抵抗能力，从而将含巯蛋白质消耗殆尽，细胞膜结构破损，使其大分子物质暴露并被氧化，最后趋向死亡。

4 结论

克氏原螯虾是水生动物中面临不同浓度镉污染耐受力和抵抗能力较强的品种：48 h克氏原螯虾LC50值26.350 mg/L，Sc值5.267 mg/L，参照我国渔业水质标准限定量0.005 mg/L，本试验Sc值超出1053.4倍；当镉浓度＞33 mg/L时，小龙虾在48 h的死亡率达80%以上，而小龙虾在镉浓度为10 mg/L时48 h的死亡率为0，组织中肝胰腺和肌肉镉含量为3.09 mg/L和0.173 mg/L，严重超出我国农产品食品限定标准0.005 mg/L。

24 h克氏原螯虾致死浓度为83 mg/L，通过组织形态学观察肝胰腺组织发现，小龙虾蓄积在肝脏的镉对其组织形态结构有严重的损伤。肝胰腺组织是小龙虾储存营养物质的重要场所，镉会导致小龙虾的肝胰腺的巯蛋白质消耗殆尽以及机能改变影响相关酶活性及解毒代谢能力等，最后死亡。

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