息半夏总生物碱的提取工艺优化及其生物活性分析

赵丽平 张雯雯 陈琼 孙伟 张文谦 马晓雯

摘要：以息半夏的块茎为原料，乙醇为超声波辅助提取溶剂，考察乙醇体积分数、超声时间、料液比、超声温度等单因素对总生物碱提取率的影响，设计正交试验优化提取工艺，并测试总生物碱的体外抗氧化和降血糖活性。结果表明，最佳提取条件为乙醇体积分数65%、提取时间60 min、料液比1∶45、超声温度65 ℃，总生物碱的提取率达0.502%；总生物碱对DPPH、ABTS自由基的清除率分别达89.90%和43.60%，对α-葡萄糖苷酶的抑制率达86.40%。该工艺简单可行，总生物碱表现出良好的体外抗氧化和降血糖生物活性。

关键词：息半夏；总生物碱；正交试验；抗氧化；降血糖

中图分类号：R284.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）05-0151-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.027            开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of extraction process of total alkaloids from Pinellia ternata and their biological activity analysis

ZHAO Li-ping，ZHANG Wen-wen，CHEN Qiong，SUN Wei，ZHANG Wen-qian，MA Xiao-wen

（School of Pharmaceutical Engineering， Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang  464000， Henan， China）

Abstract： Taking the tuber of Pinellia ternata as raw material and ethanol as ultrasonic-assisted extraction solvent， the influence of single factors such as ethanol volume fraction， ultrasonic time， material-liquid ratio and ultrasonic temperature on total alkaloids extraction rate was investigated. The orthogonal test was designed to optimize the extraction process， and the in vitro antioxidant and hypoglycemic activities of total alkaloids were tested. The results showed that the optimal extraction condition was ethanol volume fraction of 65%， extraction time of 60 min， the material-liquid ratio of 1∶45， ultrasonic temperature of 65 ℃， and the extraction rate of total alkaloids was 0.502%； the clearance of DPPH and ABTS radicals reached 89.90% and 43.60%， respectively， and the inhibition of α-glucosidase reached 86.40%. The process was simple and feasible， and the total alkaloids showed good in vitro antioxidant and hypoglycemic biological activities.

Key words： Pinellia ternata； total alkaloids； orthogonal test； antioxidant； hypoglycemic action

收稿日期：2022-08-29

基金项目：河南省科技攻关项目（212102310343）；河南省创新示范专项（201111310900）；校级高水平科研孵化器建设基金资助项目（FCL202008）；校级优秀基层组织建设项目（YXJCJXZZ202003）

作者简介：赵丽平（1979-），女，河南许昌人，副教授，硕士，主要从事分析化学研究，（电话）13083769226（电子信箱）zhaoliping200908@163.com；通信作者，张文谦（1992-），女，河南信阳人，讲师，博士，主要从事中药化学方面研究，（电话）18568296520（电子信箱）836353231@qq.com。

赵丽平，张雯雯，陈 琼，等. 息半夏总生物碱的提取工艺优化及其生物活性分析［J］. 湖北农业科学，2024，63（5）：151-155，161．

半夏为天南星科半夏（Pinellia ternata）的干燥块茎，味辛、性温。河南省信阳息县盛产半夏，其特点“个大、色白、粉量足、疗效好”，称为息半夏［1，2］。息半夏中含有生物碱、有机酸、多糖、挥发性油等多种有效成分，且生物碱是主要的活性成分之一［3，4］。生物碱具有降血糖、降脂、抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抑制慢性髓性白血病细胞等作用［4-7］。目前生物碱提取方法有很多，溶剂提取法因操作简单、成本低等优点而较为常用［8］，主要有水提取法［9］、醇类溶剂提取法［10］、亲脂性有机溶剂提取法［11］、超声波辅助提取法［12］等。

本试验以息半夏为原材料，采用乙醇作为溶剂超声波辅助提取，设置单因素试验，正交试验优化提取工艺，再经酸水-碱化-亲脂性有机溶剂萃取提取物，以除去总生物碱中的脂溶性杂质，并考察了息半夏总生物碱的抗氧化性和降血糖活性，以期为息半夏的开发利用提供一定理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

R301旋转蒸发仪器（上海一科仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；JA5003电子天平（上海方瑞仪器有限公司）；R301恒温水浴锅（上海一科仪器有限公司）；CR-040S春霖超声波清洗机（深圳市春霖超声波科技有限公司）；YLB-2000数显电热鼓风干燥箱（广州科域新材料技术有限公司）；FW-400A倾斜式高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；722可见分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司）。

息半夏（河南息半夏药业有限公司提供，经信阳农林学院陈琼教授鉴定为天南星科植物半夏的干燥块茎）；麻黄碱（0.468 mg/mL，信阳市食品药品检验所提供）；36%HCl、过硫酸钾（分析纯，武汉市中天化工有限责任公司）；99.5%甲醇、无水乙醇、维生素C（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；溴麝香草酚蓝（分析纯，国药化学试剂有限公司）；邻苯二甲酸氢钾（分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司）；1，1-2二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析纯，福州飞净生物科技有限公司）；2，2′-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS，分析纯，合肥博美生物科技有限公司）；α-葡萄糖苷酶 （超级纯，酶活力≥5 U/mg，合肥巴斯夫生物科技有限公司）；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，纯度≥99.0%，上海明丰生物科技有限公司）；阿卡波糖（分析纯，成都迪维乐普科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 息半夏生物碱的提取 参照文献［13-15］的方法，有所改动。粉碎干燥的息半夏块茎过40目筛，称取2.0 g息半夏粉末，加入50 mL体积分数为80%的乙醇溶液，在提取温度30 ℃、超声功率240 W的条件下超声提取40 min，将提取液抽滤，得到总生物碱粗提取液-I；精密量取10 mL总生物碱粗提取液，用酸溶碱沉法除去脂溶性等杂质，加入等体积的2%HCl溶液，静置30 min，将不溶物滤除，加5%NaOH溶液至pH为11～12，加入三氯甲烷于分液漏斗中萃取3次，萃取液蒸发浓缩，得息半夏生物碱样品液-II。

1.2.2 单因素试验 称取2.0 g息半夏粉末（过40目筛），保持超声功率为240 W不变条件下，在乙醇体积分数为75%、超声时间为60 min、料液比为1∶25、超声温度45 ℃的基础上，以息半夏总生物碱得率为评价指标，进行单因素试验，考察不同乙醇体积分数、超声时间、料液比、超声温度对总生物碱得率的影响［16，17］。

1.2.3 正交试验设计 乙醇作为溶剂，以息半夏总生物碱的提取率为评价指标，以乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、料液比（C）、超声温度（D）作为单因素影响因素，通过SPSS软件中的L9（34）表设计正交试验［18］，见表1。

1.2.4 标准曲线的制作 参照文献［19］酸性染料比色法。分别精密量取浓度为0.468 mg/mL的生物碱对照品溶液0.1、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于带塞试管中，加甲醇溶液至2 mL，加入0.125 mg/mL的溴麝香草酚蓝溶液10 mL（pH 5.9的PBS缓冲溶液为溶剂），振荡30 s后加入10 mL氯仿摇匀、静置，取氯仿层，用脱脂棉过滤，在416 nm波长下测吸光度。以对照品溶液的浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得标准线性回归方程A = 0.090 4C + 0.105 6，R2 = 0.999 3。结果表明，总生物碱质量浓度在3.9～39 mg/L时线性关系良好。

1.2.5 总生物碱得率的计算 将息半夏总生物碱提取液在416 nm下测吸光度，根据回归方程，计算总生物碱提取液的浓度，按式（1）计算生物碱得率。

[W=c×D×Vm×100%]               （1）

式中，W表示总生物碱得率；c表示根据吸光度计算出的溶液质量浓度（mg/mL）；D表示溶液稀释倍数；V表示供试品溶液体积（mL）；m表示样品质量（mg）。

1.2.6 验证试验 考察最佳提取工艺的准确性与稳定性，在最佳工艺条件下，进行3次平行验证试验，并计算息半夏总生物碱的平均得率。

1.2.7 息半夏总生物碱提取物生物活性试验 样品的制备按照“1.2.1”中步骤，利用最优提取条件提取息半夏总生物碱，得粗提液；将粗提液平均分成2份，一份为样品液-I；另一份粗提液经酸溶碱沉后得到样品液-II；将样品液-I和样品液-II分别经三氯甲烷萃取，真空浓缩，40 ℃干燥。得到不同质量的总生物碱提取物样品-I和样品-II，再分别用95%乙醇配制成10、15、20、25、30 mg/mL质量浓度的样品溶液。

1）DPPH自由基清除试验。参照文献［19，20］的方法，稍作改动。分别取不同质量浓度样品溶液2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液4 mL，混匀，在25 ℃条件下避光静置反应45 min后，在517 nm下测吸光度为A1；用无水乙醇代替2 mL样品溶液作为空白组，测吸光度为A0。用同质量浓度的维生素C溶液作为阳性对照。按式（2）计算不同质量浓度的总生物碱溶液对DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率=[A0-A1A0×100%]        （2）

2）ABTS自由基清除试验。精密量取7.2 mmol/L ABTS溶液27 mL与2.52 mmol/L过硫酸钾溶液3 mL于锥形瓶中，避光静置反应16 h，得到ABTS自由基溶液，用去离子水稀释3倍至在734 nm下测得吸光度为0.701作为ABTS工作液。参照文献［21，22］的方法稍作改动，取不同质量浓度样品溶液1 mL，分别加入3 mL ABTS工作液混合，室温下反应8 min，在波长734 nm下测吸光度为A1；取1 mL去离子水代替样品溶液作为空白组，测吸光度为A0。用同质量浓度的维生素C溶液作为阳性对照。按式（3）计算不同质量浓度的总生物碱溶液对ABTS自由基的清除率。

ABTS自由基清除率=[A0-A1A0×100%]       （3）

3）α-葡萄糖苷酶抑制试验。依据参考文献［23-26］方法稍作修改，取不同质量浓度样品溶液各2 mL，分别加入2 mL PBS缓冲溶液与1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液2 mL，混匀，于37 ℃水浴锅中反应15 min，分别加入4 mmol/L PNPG溶液1 mL，37 ℃温度下反应15 min后，加入0.3 mol/L Na2CO3溶液   5 mL终止反应，在波长405 nm下测吸光度为A1；用PBS缓冲溶液代替样品溶液作为空白组，测吸光度为A0。用同质量浓度的阿卡波糖溶液作为阳性对照。按式（4）计算不同质量浓度的总生物碱溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

α-葡萄糖苷酶抑制率=[A0-A1A0×100%]    （4）

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇体积分数对总生物碱得率的影响 由图1可知，乙醇体积分数在55%～75%时，总生物碱得率呈增加趋势；乙醇体积分数为75%时，总生物碱得率达最大，为0.245%，随后呈下降趋势。原因可能是随着乙醇含量的增加，溶剂渗透作用增强，总生物碱逐渐溶出；当乙醇体积分数不断增大时，溶液中脂溶性物质溶出的量也增加，使总生物碱得率下降［27，28］。因此，选取乙醇体积分数为65%、75%、85%三个水平来考察总生物碱提取的最佳乙醇体积分数。

2.1.2 超声时间对总生物碱得率的影响 由图2可知，总生物碱得率随超声时间增加呈增加趋势，时间为60 min时，得率最大，为0.284%，之后呈下降趋势。原因可能是超声时间过长，会伴随着总生物碱其他化学反应的发生，破坏了生物碱的结构，使总生物碱得率有所下降。因此，选取超声时间为50、60、70 min三个水平来考察总生物碱提取的最佳时间。

2.1.3 料液比对总生物碱得率的影响 由图3可知，总生物碱得率随溶剂体积的增大而增大，料液比为1∶35时，得率最高，为0.397 9%，之后总生物碱得率随溶剂体积的增大而有所减小。原因可能是溶剂量的增加，息半夏溶解更充分，使总生物碱更易溶出，所以得率增大；然而，当增加过多的溶剂，一是稀释总生物碱提取液，二是脂溶性成分大量溶出，使总生物碱得率下降［29］。因此，选取料液比为1∶25、1∶35、1∶45三个水平来考察总生物碱提取的最佳料液比。

2.1.4 超声温度对总生物碱得率的影响 由图4可知，总生物碱得率随超声温度升高而增大，温度达65 ℃时，得率最高，为0.401%，之后总生物碱得率随温度的升高而减小。原因可能是温度的升高有利于总生物碱的溶出，但温度过高时，总生物碱成分会发生化学结构的变化，所以得率下降。因此，选取超声提取温度为45、55、65 ℃三个水平来考察总生物碱提取的最佳温度。

2.2 正交试验结果与分析

以乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、料液比（C）、超声温度（D）为单因素，息半夏总生物碱得率为评价指标，设计四因素三水平的正交试验结果如表2所示。

由表2中的R值可判断，对息半夏总生物碱得率影响顺序为D> B> C > A，即超声温度的影响最大，其次是超声时间、料液比、乙醇体积分数。通过表中的K值可判断出最佳的提取工艺条件是A1B2C3D3，即乙醇体积分数为65%，超声时间为60 min，料液比为1∶45，超声温度为65 ℃。

在最佳工艺条件下提取息半夏总生物碱，重复3次，算其平均值。3次得率分别为0.502%、0.498%、0.506%，总生物碱的平均得率为0.502%，RSD为0.80%<1.5%，试验结果优于正交试验的其他条件组合，表明该最佳工艺条件稳定、可行。

2.3 总生物碱提取物的生物活性结果分析

2.3.1 DPPH、ABTS自由基清除试验结果与分析 由图5、图6可知，DPPH和ABTS自由基的清除率随样品质量浓度的增加而增大；分别对DPPH和ABTS自由基进行清除，经过酸溶碱沉的总生物碱样品-II比粗提样品-I对自由基的清除率要大；样品质量浓度在30 mg/mL时，样品-II对DPPH、ABTS自由基的清除率分别达89.90%和43.60%；样品质量浓度为10～30 mg/mL范围内，总生物碱对DPPH自由基的清除率要大于ABTS自由基，这可能与总生物碱结构有关；两种样品对自由基的清除能力均小于维生素C，但仍表现出较好的抗氧化活性。

2.3.2 降血糖活性试验结果与分析 由图7可知，α-葡萄糖苷酶的抑制率随样品质量浓度的增加而增大；酸溶碱沉的样品-II比粗提样品-I对α-葡萄糖苷酶的抑制率要大；样品质量浓度在10 mg/mL时，样品-II对α-葡萄糖苷酶的抑制率达86.40%；样品质量浓度在2～10 mg/mL范围，总生物碱对α-葡萄糖苷酶的抑制作用小于阿卡波糖，但仍表现出良好的抑制作用。

3 小结

正常机体内含有一定的自由基，当体内的自由基过多时会导致细胞膜受损，产生氧化应激增加，导致抗氧剂能力下降，就会引起不同疾病，比如高血糖、高血脂、糖尿病等［30］。本试验对息半夏总生物碱超声波辅助提取，其活性试验显示，息半夏总生物碱对ABTS和DPPH自由基均有清除作用，且对DPPH自由基的清除能力显著高于ABTS自由基；对α-葡萄糖苷酶活性也有抑制作用，质量浓度为10 mg/mL时，抑制率高达86.40%；同时经酸溶碱沉的总生物碱抗氧化和降糖活性均高于粗样品。试验表明，经酸溶碱沉的息半夏总生物碱具有明显的抗氧化和降血糖生物活性。该试验为天然的抗氧化及降血糖成分研究提供一定的理论基础，同时也拓宽了信阳息半夏的开发和利用。

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