全自动固相萃取-HPLC-FLD柱后衍生法测定粮食中黄曲霉毒素B1

李俊毅 李窕妍

摘 要：采用全自动固相萃取仪，建立适用于粮食中黄曲霉毒素B1的检验方法。样品经提取液提取，用全自动固相萃取-免疫亲和柱净化，采用高效液相色谱-荧光检测（High Performance Liquid Chromatography-Fraunhofer Line Discriminator，HPLC-FLD）柱后衍生法进行测定。结果表明，黄曲霉毒素B1在0.1～

20.0 ng·mL-1线性良好，R2为0.999 987；检出限和定量限分别为0.03 μg·kg-1和0.1 μg·kg-1；3水平加标回收率为84.9%～88.5%。本方法自动化程度高、重现性好，可以满足粮食中黄曲霉毒素B1测定的要求。

关键词：全自动固相萃取；高效液相色谱-荧光检测；柱后衍生；黄曲霉毒素B1

Determination of Aflatoxin B1 in Grain by Automatic Solid Phase Extraction with HPLC-FLD Post-Column Derivatization

LI Junyi1， LI Tiaoyan2

（1.Jieyang Institute of Food Inspection， Jieyang 522000， China;

2.Guangdong Province Jieyang City Quality Measurement Supervision and Testing Institute， Jieyang 522000， China）

Abstract： A fully automatic solid-phase extractor was used to establish a method for the detection of aflatoxin B1 in grain. The samples were extracted by extraction， cleaned up with automatic solid-phase extraction-immunoaffinity column， and determined by high performance liquid chromatography-fraunhofer line discriminator （HPLC-FLD） post-column derivatization. The results showed that aflatoxin B1 had good linearity at 0.1～20.0 ng·mL-1， R2 was

0.999 987， and the limits of detection and quantification were 0.03 μg·kg-1 and 0.1 μg·kg-1， respectively. The recovery rate of horizontal spiking was 84.9%～88.5%. This method has a high degree of automation and good reproducibility， which can meet the requirements of the determination of aflatoxin B1 in grains.

Keywords： automatic solid phase extraction; high performance liquid chromatography-fraunhofer line discriminator; post-column derivations; aflatoxin B1

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一种双呋喃环类毒素，属于真菌类毒素，常见的黄曲霉毒素可分为B族、G族和M族三大类，目前已经发现的黄曲霉毒素及其衍生物超过20种[1]。黄曲霉会污染粮食、坚果、油脂及其制品，如大米、小麦、瓜子、大豆油等[2]。食品被黄曲霉和寄生曲霉污染后都可能会产生黄曲霉毒素，其中AFTB1的毒性最强[3]，会对人体健康造成极大的危害，属Ⅰ类致癌物。

食品中黄曲霉毒素B1的检测方法主要有液质联用法[4]、高效液相色谱法[5]、QuEChERS法结合其他检测方法[6]、酶联免疫吸附筛查法[7]以及薄层层析法等[8]。其中，高效液相色谱法操作相对简单，实验人员易上手，仪器的使用和维护成本较低，检测灵敏度高、稳定性好[9]。本研究在国标方法高效液相色谱-荧光检测（High Performance Liquid Chromatography-Fraunhofer Line Discriminator，HPLC-FLD）柱后衍生法的基础上，对前处理方法进行改进和优化，结合全自动固相萃取仪-免疫亲和柱对样品进行全自动净化，有效解决了人工过柱流速不稳定、重现性较差、大批量样品处理效率不高等问题，避免了前处理阶段由人员操作带来的系统误差，提升了工作

效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阴性大米样品；市售大米样品；甲醇、乙腈；乙腈中黄曲霉毒素B1标准物质（100 μg·mL-1），阿尔塔。

1.2 仪器与设备

Waters e2695/2475高效液相色谱仪，配荧光检测器和柱后衍生系统；AflaStar黄曲霉毒素免疫亲和柱（3 mL，200 ng）；Fotector-02HT全自动固相萃取仪，Reeko公司；AutoEVA-20Plus全自动平行浓缩仪，Reeko公司；V20垂直振荡器，RayKal公司；BSA224S-CW电子天平，Sartorius公司。

1.3 实验方法

1.3.1 检测条件

Symmetry C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；等梯度洗脱；流动相：水+乙腈+甲醇（68+16+16）；流速：1 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；激发波长：360 nm；发射波长：440 nm；柱后衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生溶液流速：0.2 mL·min-1；衍生反应管温度：70 ℃。

1.3.2 标准曲线的配制

精确移取0.5 mL黄曲霉毒素B1标准物质

（100 μg·mL-1）至5 mL容量瓶中，用乙腈稀释混匀，得到10.0 μg·mL-1的标准储备液。精确移取1.0 mL标准储备液至100 mL容量瓶，用乙腈稀释混匀，得到100 ng·mL-1的标准中间液。用流动相（水+乙腈+甲醇，68+16+16）将标准中间液分别稀释成

0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的标准工作曲线，供高效液相色谱仪测定。

1.3.3 样品的制备

称取5 g预先充分粉碎均匀的大米样品至50 mL离心管，加入20 mL 70%的甲醇溶液，漩涡混合后置于垂直振荡器中，以1 000 r·min-1振荡20 min，

6 500 r·min-1离心10 min。移取4 mL上清液至进样管中，加入38 mL 1%曲拉通X-100的PBS，充分混合均匀。将上述样液置于高通量全自动固相萃取仪中萃取，收集洗脱液至20 mL浓缩管中，置于全自动平行浓缩仪，于50 ℃条件下将洗脱液氮吹至近干，用流动相定容至1.0 mL，置于涡旋混合器中涡旋30 s溶解残渣，用0.22 μm PTFE滤膜过滤，测定。固相萃取程序见表1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、检出限与定量限

将1.3.2项系列标准工作液注入液相色谱仪，以黄曲霉毒素B1的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得到黄曲霉毒素B1的线性回归方程为Y=3.76×106X-6.31×104，相关系数R2为

0.999 987，在0.1～20.0 ng·mL-1线性关系良好。

依据《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）的规定，当称取样品5 g时，高效液相柱后碘衍生法测定AFTB1的检出限（Limit of Detection，LOD）为

0.03 μg·kg-1，定量限（Limit of Quantification，LOQ）为0.1 μg·kg-1[10]。本实验结合国家标准规定，称取

5 g阴性样品，加入1.5 μL 100 ng·mL-1标准中间液，按照1.3.3项方法进行样品制备，测得黄曲霉毒素B1的S/N值为34.18，满足S/N≥3的要求，且峰型清晰可辨（见图1），因此确定本方法AFTB1的LOD为

0.03 μg·kg-1；同理，确定本方法AFTB1的LOQ为

0.1 μg·kg-1。

2.2 精密度与加标回收率实验

在阴性样品中，采用外加法添加黄曲霉毒素B1标准物质，分别制备1×LOQ、2×LOQ、10×LOQ

3个添加浓度的加标样品，每个浓度制备3个平行，按照1.3.3项方法进行样品制备，加标回收实验结果见表2。从表2可以看出，3个添加水平下，平均加标回收率在84.9%～88.5%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）在2.24%～4.92%，符合《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—

2017）的规定，方法准确可靠。

2.3 实际样品检测

在多个商场、超市和市场随机采集30批次的大米样品，采用本方法进行测定，其中有13批次的样品检出AFTB1，含量在0.276～2.272 μg·kg-1。抽查的30批次大米样品中AFTB1含量均小于10 μg·kg-1，符合《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》

（GB 2761—2017）规定的限量要求。

3 结论

本文建立了全自动固相萃取-HPLC-FLD柱后衍生法测定粮食中黄曲霉毒素B1的方法。实验采用了稳定性好的HPLC-FLD，同时结合全自动固相萃取仪、全自动平行浓缩仪、垂直振荡仪等一系列自动化设备替代人工操作，优化了前处理的关键条件，同时考察了标准曲线、方法检出限和定量限、精密度和加标回收率等。结果表明，该方法操作简便、准确度高、重现性好，有效避免了人工操作带来的系统误差，适合检测大批量样品，可以满足粮食中黄曲霉毒素B1的测定要求。

参考文献

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[10]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定：GB 5009.22—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.