石榴皮提取物指纹图谱的建立及指标成分含量测定
2024-06-17刘琦珺林佳丽魏德泷梁立陈语心岳文慧颜军
刘琦珺 林佳丽 魏德泷 梁立 陈语心 岳文慧 颜军
摘要：为建立石榴皮提取物的指纹图谱及指标成分含量测定的高效液相色谱方法，为石榴皮提取物质量控制提供参考，文章采用高效液相色谱法建立石榴皮提取物指纹图谱，并通过相似度评价结合化学计量法分析10个批次石榴皮提取物的质量差异，同时以安石榴苷和鞣花酸作为指标成分建立含量测定方法。结果表明，建立10个批次石榴皮提取物指纹图谱，共28个共有峰，其中8 号峰为α-安石榴苷，13号峰为β-安石榴苷，28号峰为鞣花酸，S2、S4、S10 3个批次的石榴皮提取物的相似度<0.9，聚类分析将10个批次石榴皮提取物分为5类，通过VIP值筛选确定安石榴苷和鞣花酸为主要差异性指标成分，测得安石榴苷和鞣花酸含量分别为28.80～288.90 mg/g和6.12～17.73 mg/g。该研究建立的指纹图谱及含量测定方法可为石榴皮提取物质量控制与评价提供参考。
关键词：石榴皮提取物；指纹图谱；含量测定；质量研究
中图分类号：TS202.3
文献标志码：A
文章编号：1000-9973（2024）06-0182-07
Establishment of Fingerprint of Pomegranate Peel Extracts and
Determination of Content of Index Components
LIU Qi-jun1，2， LIN Jia-li3， WEI De-long1，2， LIANG Li1，2， CHEN Yu-xin1，2，
YUE Wen-hui1，2， YAN Jun1，2*
（1.School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106， China; 2.Key Laboratory of Medicinal and Edible Plant Resources Development in Institutions of Higher Education in Sichuan Province， Chengdu 610106， China; 3.Easton Biopharmaceuticals Co.， Ltd.， Chengdu 611731， China）
Abstract： To establish a high performance liquid chromatography for the fingerprint of pomegranate peel extracts and determination of the content of index components， and to provide references for quality control of pomegranate peel extracts， in this paper， the fingerprint of pomegranate peel extracts is established by high performance liquid chromatography， and the quality difference of ten batches of pomegranate peel extracts is analyzed by similarity evaluation combined with chemometrics method. At the same time， with punicalagin and gallogen as the index components， the content determination method is established. The results show that a total of 28 common peaks are identified in the established fingerprints of ten batches of pomegranate peel extracts， among which， No.8 peak is α-punicalagin， No.13 peak is β-punicalagin， and No.28 peak is gallogen. The similarity of pomegranate peel extracts from batches S2， S4 and S10 is <0.9. The ten batches of pomegranate peel extracts are divided into five categories by cluster analysis， and through VIP value screening， punicalagin and gallogen are identified as the main differential index components. The content of punicalagin and gallogen is measured to be 28.80～288.90 mg/g and 6.12～17.73 mg/g respectively. The fingerprint and content determination method established in the research can provide references for quality control and evaluation of pomegranate peel extracts.
Key words： pomegranate peel extract; fingerprint; content determination; quality research
收稿日期：2023-11-29
基金项目：四川省科学技术厅国际科技创新合作项目（2020YFH0205）
作者简介：刘琦珺（1999—），女，硕士研究生，研究方向：天然产物有效成分分析。
*通信作者：颜军（1971—），男，教授，硕士，研究方向：天然产物有效成分检测技术及相关功能验证。
食品添加剂通常用于增加食品的营养价值，改善其感官（如颜色、风味）和工艺特性，以及延长其保质期[1]，保护食品免受微生物的侵害。在过去的几十年里，合成抗氧化剂如丁基羟基甲苯（BHT）、丁基羟基茴香醚（BHA）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）等已被广泛用作食品添加剂，以抑制或延缓氧化[2]。然而，考虑到它们可能的毒性和致癌作用，天然食品添加剂代表了食品行业中最具创新性的领域之一，科学界已经转向制备天然来源的更安全的抗氧化剂，作为合成抗氧化剂的替代品[3-4]。
石榴（Punica granatum L.）是构成酚类化合物的天然丰富来源。它通常是新鲜食用或以果汁的形式商业化，其果皮为加工过程中主要的副产物，常作为废弃物被丢弃，有研究表明，石榴皮中的生物活性物质含量高于其可食用的果肉部分，这些化合物具有抗菌和抗氧化活性，能有效地防止脂肪氧化并延缓不同微生物的生长[5]，石榴皮提取物（PPE）可用作生物活性成分和添加剂以开发功能性食品[6-8]。洪军等[9]发现石榴皮提取物对大肠杆菌等5种食源性致病菌有抑菌效果，且与其他生物源食品添加剂有协同作用。 Kaderides等[3]发现包封石榴皮提取物可以通过抑制氧化和病原微生物的生长使肉类、乳制品类和油类等不同食物系统的保质期延长，且对产品的最终感官特性无负面影响，从而预测石榴皮有成为食品添加剂的潜力[10-12]。石榴皮提取物具有改善不同食品如饮料的功能性质的潜力。但我国地域环境差异大，不同产地石榴皮提取物的成分含量不同，可采用中药材质量评价方法，使用指纹图谱对石榴皮提取物的不同产地进行区分比较[13-15]。
中药指纹图谱与化学计量学模式相结合已成为最常用、最有效的控制药材质量的手段之一。石榴皮为天然产物，其提取物成分较复杂，因此为了更好地对石榴皮提取物进行质量控制，需要建立指纹图谱评价石榴皮提取物。本实验收集不同产地石榴皮进行提取后建立指纹图谱，结合化学计量法进行质量评价，并对其指标性成分进行含量测定，对石榴皮提取物的质量进行全面分析。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
鞣花酸对照品（批号：wkq21010403，四川省维克奇生物科技有限公司）;安石榴苷对照品（批号：Y11S11Y124050，上海源叶生物科技有限公司）。实验用石榴皮来源见表1，经成都大学何钢副教授鉴定为石榴科石榴属石榴（Punica granatum L.）的果皮;甲醇为色谱级，实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Agilent 1260型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司;FA1004型分析天平 上海越平科学仪器有限公司;UPF-Ⅱ-10T超纯水机 四川优普超纯科技有限公司;Labconco 430B冷冻干燥机 广州市赛拓仪器科技有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；JY-1000A型粉碎机 上海塞耐机械进出口有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品的制备
去除石榴皮中的泥沙、霉变及虫蛀部位，干燥后粉碎过80目筛。按料液比1∶20加入50%乙醇，超声提取30 min，取滤液旋蒸使乙醇挥发，冷冻干燥即得。
1.3.2 溶液的配制
1.3.2.1 对照品溶液的配制
取安石榴苷对照品适量，精密称定，加水溶解制备成400μg/mL的安石榴苷储备溶液。取鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制备成40μg/mL的鞣花酸储备溶液。
1.3.2.2 供试品溶液的制备
称取石榴皮提取物10 mg于容量瓶中加水溶解后定容，即得1 mg/mL的供试品溶液，使用微孔滤膜过滤。
1.3.3 液相色谱条件的筛选
参考文献[16-18]的方法，以DAD为检测器，选择甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～10 min，1%～5% A；10～15 min，5% A；15～40 min，5%～60% A；40～45 min，60%～1% A），柱温35 ℃，进样量10μL。选择色谱柱Supersil ODS-B、Hypersil ODS2、Chromegabond WR C18、Epic C18按照既定方法进样分析，以峰形和分离度等参数为指标选择合适的色谱柱，并优化洗脱程序的时间和流动相比例。
1.3.4 指纹图谱的建立和相似度评价
将10个批次石榴皮按1.3.1中方法制备，将其提取物依次编号为S1～S10，见表1。以1.3.3中方法筛选色谱条件并进行测定，记录HPLC色谱图，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版软件进行分析，以S9为参照图谱，0.1 min为时间宽度，采用平均值法和多点校正方式生成指纹图谱和对照图谱R，并将生成的对照图谱R与10个批次的石榴皮提取物液相图谱进行相似度计算。
1.3.5 化学计量分析
1.3.5.1 聚类分析
聚类分析是将物理或抽象对象的集合分组为由类似的对象组成的多个类的分析过程[19-20]。一般为避免主观造成的误差，常常使用聚类分析得到更加客观准确的分类。以10个批次石榴皮提取物的28个共有峰峰面积为变量，运用SPSS软件进行分析。
1.3.5.2 判别分析
判别分析是对已知分类的数据进行统计判别，建立判别函数，从而对未知类别的新数据进行判别，将其归为类别中[21-22]。将各产地石榴皮提取物中安石榴苷和鞣花酸含量及聚类分析的分类结果导入IBM SPSS 22.0进行判别分析，再与聚类分析的结果进行对比分析。
1.3.6 指标成分含量的测定
1.3.6.1 变量重要性投影（VIP）
将 10个批次的石榴皮提取物液相图谱中共有峰的峰面积数据导入SIMCA 14.1 软件，使用偏最小二乘法判别分析模式进行分析，筛选VIP＞1的差异成分，为后续含量测定进行指导[23-24]。
1.3.6.2 专属性和系统适用性实验
取1.3.2中对照品溶液和供试品溶液进样检测，以1.3.3筛选色谱条件进行测定，记录安石榴苷和鞣花酸色谱峰的理论塔板数和保留时间等参数。
1.3.6.3 线性范围
取1.3.2.1中对照品溶液配制成系列标准工作液进样分析，以浓度和对应的峰面积为横、纵坐标进行标准曲线的绘制，计算回归方程和相关系数。
1.3.6.4 进样精密度
取1.3.2.1中对照品溶液连续进样6次，记录峰面积并计算相对标准偏差（RSD）。
1.3.6.5 重复性考察
称取6份同一批次石榴皮提取物，按1.3.2.2制备后连续进样分析，记录峰面积并根据回归方程计算安石榴苷和鞣花酸含量及RSD。
1.3.6.6 稳定性考察
按1.3.2.2制备供试品溶液，放置0，0.5，1，2，4，6，12 h后分别进样分析，以安石榴苷和鞣花酸的峰面积变化的RSD判断石榴皮提取物的稳定性。
1.3.6.7 加样回收率考察
称取同一批次石榴皮提取物适量，按1.3.2.2制备供试品溶液，加入相当于供试品溶液80%、100%、120%的安石榴苷，每个浓度3份，进样检测，记录峰面积并计算加样回收率和RSD。
1.3.6.8 样品含量的测定
取10个批次石榴皮按1.3.1制备石榴皮提取物后，按1.3.2.2制备供试品溶液，每个批次平行制备3份，以1.3.3筛选色谱条件进行测定。
2 结果分析
2.1 高效液相色谱法的建立
2.1.1 色谱柱的筛选
由图1可知，Epic C18色谱柱色谱峰较其他色谱柱多且能够延长强极性物质的保留时间，便于进一步对流动相梯度洗脱进行优化，缩短分析周期，因此选择Epic C18色谱柱对石榴皮提取物进行测定。
2.1.2 洗脱程序的优化
由图2可知，选择甲醇（A）-0.2%磷酸（B）为流动相，并优化了洗脱程序（0～8 min，15% A，8～15 min，15～60% A，15～18 min，60%～15% A，18～20 min，15% A），将时间缩短至20 min，提高样品的分析速度。
2.2 指纹图谱的建立及相似度分析
由图3可知，各批次石榴皮提取物的液相色谱图相似，不同批次石榴皮提取物的主要成分差异不大，主要存在含量上的差异。将10个批次石榴皮提取物的液相图谱导入指纹图谱分析软件后生成指纹图谱和对照图谱（见图4），10个批次石榴皮提取物存在28个共有特征峰，其峰面积占总峰面积的95%以上。其中8号峰为α-安石榴苷，13号峰为β-安石榴苷，28 号峰为鞣花酸。将10个批次石榴皮提取物进行相似度评价，结果见表2。与生成的对照图谱比较发现，S2、S4、S10 3个批次的石榴皮提取物与其他批次的石榴皮提取物差异较大，相似度<0.9。各批次石榴皮提取物的液相色谱图主要峰群基本一致，表明10个不同批次的样品主要组成成分差异不大，差异主要体现在不同物质的含量上，得到的对照图谱与S1、S3、S5和S9的相似度最高。
2.3 化学计量分析
2.3.1 聚类分析
10个批次的石榴皮提取物聚类树状图见图5。以组间连接法结合余弦距离对10个批次的石榴皮提取物按照共有峰面积进行聚类分析。以5为距离切割的树状图，将不同来源的10个样本分为5类，S5、S6、S7、S10聚为一类，S1聚为一类，S8、S9聚为一类，S2、S4聚为一类，S3聚为一类。
2.3.2 判别分析
不同产地石榴皮提取物判别分析散点图见图6。图中的圆圈代表不同产地的石榴皮提取物，组质心分别代表石榴皮提取物的5个分类。使用聚类分析提供5个初始分类，IBM SPSS 22.0软件进行交叉回代验证，结果显示其判别正确率为100%，说明判别函数准确，可用于不同产地石榴皮提取物分类的判断，5类石榴皮提取物判别分析散点图分布进一步验证了聚类分析分类的合理性。以安石榴苷和鞣花酸为指标，5类石榴皮提取物的Fisher判别函数如下：
第一类=2.178×安石榴苷+0.164×鞣花酸-25.571。
第二类=4.028×安石榴苷+0.243×鞣花酸-64.271。
第三类=6.481×安石榴苷+0.066×鞣花酸-63.284。
第四类=6.408×安石榴苷-0.610×鞣花酸-50.199。
第五类=2.725×安石榴苷+0.058×鞣花酸-14.937。
2.4 指标成分含量的测定
2.4.1 变量重要性投影（VIP）
为进一步分析石榴皮的差异标志物，以10个批次石榴皮提取物样品指纹图谱的28个共有峰峰面积为变量，应用SIMCA 14.1软件计算VIP值，结果见图7。标记出贡献较大的成分，分别为峰8（α-安石榴苷）、峰13（β-安石榴苷）、峰28（鞣花酸），它们是引起差异的主要标志性成分，故在本研究中选取安石榴苷和鞣花酸作为石榴皮提取物指标性成分进行含量测定。
2.4.2 方法学验证
2.4.2.1 专属性和系统适用性
对照品溶液和石榴皮提取物溶液的色谱图见图8。
由图8可知，安石榴苷和鞣花酸的分离度较好。对照品溶液中专属性和系统适用性实验结果见表3，石榴皮提取物溶液专属性和系统适用性实验结果见表4。
2.4.2.2 线性和范围
考察了安石榴苷和鞣花酸的线性关系，结果表明安石榴苷的两种构型均具有较好的线性关系，本研究以两种构型的安石榴苷总峰面积计算仍具有良好的线性关系，鞣花酸和安石榴苷在各自的浓度范围内线性关系良好，相关系数r>0.999，结果见表5。
2.4.2.3 精密度
6次进样安石榴苷和鞣花酸的峰面积RSD分别为0.18%和0.7%，结果表明仪器的精密度良好。
2.4.2.4 重复性
同一批次的6份石榴皮提取物样品中测定的安石榴苷和鞣花酸含量RSD分别为1.02%和1.43%，结果表明该方法的重复性良好。
2.4.2.5 稳定性
石榴皮提取物溶液在放置0，1，2，3，6，8，12，16，24 h后，安石榴苷的α构型和β构型在放置过程中相互转换，因此以安石榴苷总峰面积考察其稳定性。以安石榴苷和鞣花酸的峰面积为指标，安石榴苷的峰面积RSD为0.76%，鞣花酸的峰面积RSD为2%，结果表明石榴皮提取物的稳定性良好。
2.4.2.6 加样回收率
石榴皮提取物中安石榴苷的加样回收率为96%～105%，鞣花酸的加样回收率为93%～100%。
2.4.2.7 样品含量的测定
10个批次石榴皮提取物安石榴苷和鞣花酸含量测定结果见表6。实验结果表明，安石榴苷含量在28.80～288.90 mg/g之间，鞣花酸含量在6.12～17.73 mg/g之间。其中 S1为高含量的安石榴苷和较高含量的鞣花酸，聚为一类；S2、S4的安石榴苷和鞣花酸含量均较低，聚为一类；S3为中含量的安石榴苷和鞣花酸，聚为一类；S8、S9为较高含量的安石榴苷和高含量的鞣花酸，聚为一类；S5、S6、S7、S10为中含量的安石榴苷和低含量的鞣花酸，聚为一类。以10个批次中安石榴苷和鞣花酸的含量进一步验证聚类分析的合理性。
3 结果与讨论
由于石榴皮提取物来源于天然产物石榴皮，其中指标成分主要受产地、气候、水土等因素的影响。石榴皮提取物在市面上有直接销售，但在市面上所售卖的石榴皮提取物多以鞣花酸作为含量标示，且不同厂家的提取工艺不同导致含量也存在差异。安石榴苷现未从其他植物中提取得到，是暂时只存在于石榴皮中的特异性成分，在本研究中发现安石榴苷也是引起石榴皮提取物差异的主要标志性成分之一，在石榴皮提取物质量研究中也应重视。因此，建议石榴皮提取物应该建立产品国家标准，对主要的指标成分给予限量。
通过HPLC建立10个批次的石榴皮提取物指纹图谱，得到28个共有峰，共有峰峰面积占总峰面积的95%以上，已鉴别了其中2个化合物（3个峰），分别为安石榴苷和鞣花酸，进行相似度分析，发现S2、S4、S10 3个批次的石榴皮提取物与其他批次的石榴皮提取物差异较大，通过化学计量分析将不同批次石榴皮提取物分为5类，并通过判别分析建立 Fisher 判别函数，交叉回代验证分类正确率为 100%，判别分析进一步印证了聚类分析分类的准确性。10个批次石榴皮提取物中S5、S6、S7、S10聚为一类，S1聚为一类，S8、S9聚为一类，S2、S4聚为一类，S3聚为一类，通过VIP值筛选出安石榴苷和鞣花酸为主要差异成分，故而在本研究中选取安石榴苷和鞣花酸作为指标性成分进行含量测定。
安石榴苷中存在一对同分异构体且二者能够相互转换[25-26]，所购安石榴苷标准品也为α构型和β构型的混合物，在进行样品放置稳定性考察中也发现安石榴苷的α构型和β构型在放置过程中相互转换，所以进行含量测定时以总量计。以本研究所建立的提取和含量测定方法测得10个批次石榴皮安石榴苷含量为28.80～288.90 mg/g，鞣花酸含量为6.12～17.73 mg/g，在2020年《中国药典》中规定石榴皮中鞣花酸含量不低于0.3%，未对安石榴苷含量进行规定，10个批次石榴皮提取物中鞣花酸含量均符合要求，根据测定结果建议规定石榴皮提取物中安石榴苷含量不低于28.80 mg/g，鞣花酸含量不低于6.12 mg/g。
随着经济的发展和生活品质的提高，消费者对食品安全的关注度越来越高，不断研发天然提取的功能添加剂，也成为世界各国食品添加剂的研发趋向。目前应用的文献综述表明，在肉类、鱼类、家禽、乳制品、食用油和脂肪等食品中添加石榴皮提取物，发现其在加工或储存条件下的物理化学和微生物稳定性以及保质期都有所增加，相信在未来石榴皮提取物作为食品添加剂的使用会越来越多，相应地对其质量把控需要重视起来，在现行的2020版《中国药典》中对石榴皮进行了规定，未见对石榴皮提取物的质量控制。本实验建立了石榴皮提取物的高效液相指纹图谱，结合相似度分析、聚类分析等对10个批次石榴皮提取物进行分析比较与综合评价，所建立的方法准确可靠，可为石榴皮提取物质量标准的制定提供参考。
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