基于UPLC-MS/MS对3种类型洋葱中有机酸和氨基酸成分的分析

2024-06-17马芮萍段筱筠杨阳王雪娇李晓东周春红

中国调味品 2024年6期

马芮萍段筱筠杨阳王雪娇李晓东周春红

摘要：基于UPLC-MS/MS建立了快速测定洋葱中15种有机酸和18种氨基酸的方法。结果表明，15种有机酸和18种氨基酸在各自的线性范围内线性关系良好，检出限范围为0.000 7～3.989 4 mg/kg，定量限范围为0.002 2～13.297 9 mg/kg；加标回收率为59.2%～122.9%，RSD范围为0.61%～5.26%；3种类型洋葱中共检出6种有机酸和18种氨基酸，其中必需氨基酸6种，条件必需氨基酸2种，非必需氨基酸10种；洋葱样品中有机酸总量在392.05～669.03 mg/kg之间，平均含量为561.54 mg/kg，其中富马酸的含量最高，占有机酸总量的98%，黄洋葱中有机酸含量高于紫洋葱和白洋葱；洋葱样品中氨基酸总量在6 038.54～8 113.38 mg/kg之间，平均含量为6 927.31 mg/kg，其中L-赖氨酸含量最高，占氨基酸总量的39.43%；洋葱样品中检测出6种必需氨基酸，平均含量为3 202.04 mg/kg，占氨基酸总量的46.18%，紫洋葱中必需氨基酸总量和氨基酸总量高于黄洋葱和白洋葱。该方法灵敏度高、操作简便，可以广泛应用于洋葱中有机酸和氨基酸含量的测定，测定的数据可为洋葱的精深加工提供一定的理论依据。

关键词：洋葱；UPLC-MS/MS；有机酸；氨基酸

中图分类号：TS207.3

文献标志码：A

文章编号：1000-9973（2024）06-0168-08

Analysis of Components of Organic Acids and Amino Acids in

Three Types of Onions Based on UPLC-MS/MS

MA Rui-ping， DUAN Xiao-yun， YANG Yang， WANG Xue-jiao， LI Xiao-dong， ZHOU Chun-hong^*

（Gansu Provincial Product Quality Supervision and Inspection Research Institute，

Lanzhou 730050， China）

Abstract： A rapid determination method of 15 organic acids and 18 amino acids in onions is established based on UPLC-MS/MS. The results show that 15 organic acids and 18 amino acids show good linear relationship in their respective linear ranges， with the limit of detection ranging from 0.000 7 mg/kg to 3.989 4 mg/kg and the limit of quantitation ranging from 0.002 2 mg/kg to 13.297 9 mg/kg. The spiked recovery rates are 59.2%～122.9%， and RSD is 0.61%～5.26%. A total of 6 organic acids and 18 amino acids are detected in three types of onions， including 6 essential amino acids， 2 conditionally essential amino acids and 10 non-essential amino acids. The total content of organic acids in onion samples ranges from 392.05 mg/kg to 669.03 mg/kg， with the average content of 561.54 mg/kg， among which， the content of fumaric acid is the highest， accounting for 98% of the total content of organic acids， and the content of organic acids in yellow onion is higher than that in purple onion and white onion. The total content of amino acids in onion samples ranges from 6 038.54 mg/kg to 8 113.38 mg/kg， with the average content of 6 927.31 mg/kg， among which， the content of L-lysine is the highest， accounting for 39.43% of the total content of amino acids.Six kinds of essential amino acids are detected in onion samples， with the average content of 3 202.04 mg/kg， accounting for 46.18% of the total content of amino acids. The total content of essential amino acids and amino acids in purple onion is higher than that in yellow onion and white onion. This method has high sensitivity and simple operation， and can be widely used for the determination of the content of organic acids and amino acids in onions. The determined data can provide a certain theoretical basis for the deep processing of onions.

Key words： onion; UPLC-MS/MS; organic acids; amino acids

收稿日期：2023-12-28

基金项目：甘肃省市场监督管理局科技计划项目（SSCJG-SP-202109）

作者简介：马芮萍（1987—），女，甘肃酒泉人，工程师，硕士，研究方向：食品质量安全检测及色谱技术分析。

*通信作者：周春红（1965—），女，甘肃兰州人，正高级工程师，硕士，研究方向：食品及食品相关产品风险监测。

洋葱（Allium cepa L.）是百合科葱属二年生草本植物，又名玉葱、圆葱、葱头等。洋葱口感辛辣、肉质柔嫩、多汁，具有特殊的风味，亦被用作香料^[1-3]。洋葱富含含硫化合物、氨基酸、有机酸、维生素、矿物质等营养成分，具有抗病毒、杀菌、降血脂等保健功效^[4-5]。甘肃省因其特殊的地理位置，具有规模化生产的优势区域，近年来洋葱种植面积稳定在1.7万公顷左右，是中国重要的出口创汇蔬菜^[6-7]。

有机酸和氨基酸广泛存在于植物中，不仅可维持自身的新陈代谢，而且可预防疾病、增强人体免疫力等^[8-9]。有机酸的检测方法主要有离子色谱法^[10]、液相色谱法^[11]、气相色谱-质谱法^[12]、液相色谱-质谱法^[13]等，氨基酸的检测方法主要有氨基酸分析仪法^[14]、高效液相色谱法^[15]、气相色谱法^[16]、液相色谱-质谱联用法^[17]等。在这些检测方法中，液相色谱-质谱联用法前处理无需衍生，且处理简便、灵敏度高、分析时间短、通量高，可应用于有机酸和氨基酸的快速检测。

本研究以紫洋葱、黄洋葱、白洋葱3种不同类型的洋葱为研究对象，采用UPLC-MS/MS建立了同时测定洋葱中有机酸和氨基酸含量的方法，比较不同类型洋葱中有机酸和氨基酸含量的差异性，以期为洋葱的精深加工提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

洋葱样品均为市售。

1.2 试剂

标准物质：21种氨基酸（1 000μg/mL）标准物质：上海安谱实验科技股份有限公司；富马酸（100μg/mL）、香草酸（100μg/mL）、咖啡酸（100μg/mL）、β-香豆酸（100μg/mL）、阿魏酸（100μg/mL）、水杨酸（1 000μg/mL）、丁二酸（100μg/mL）、对羟基苯甲酸（100μg/mL）、龙胆酸（100μg/mL）、柠檬酸（100μg/mL）、乳酸（100μg/mL）、己二酸（纯度≥98%，10 mg）、绿原酸（纯度≥98%，10 mg）、丁香酸（纯度≥98%，20 mg）、酒石酸（纯度≥98%，100 mg）、苹果酸（纯度≥98%，100 mg）：天津阿尔塔科技有限公司；甲醇、乙腈（均为质谱纯）：美国Merck公司；甲酸、乙酸铵（均为色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器与设备

Triple QUAD^TM4500超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪美国Sciex公司；ACQUITY UPLC^?BEH C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.7μm）、ACQUITY UPLC^?T3（100 mm×2.1 mm，1.7μm）、ACQUITY UPLC HILIC-Z（150 mm×2.1 mm，2.7μm）、ACQUITY UPLC C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.7μm）、ACQUITY UPLC BEH Amide（100 mm×2.1 mm，1.7μm）美国Waters公司；VXR涡旋振荡器德国IKA公司；AH-50全自动均质器睿科集团（厦门）股份有限公司；KH30R-Ⅱ冷冻离心机湖南凯达科学仪器有限公司；KQ-600DE超声波清洗器东莞市科桥超声波设备有限公司；十万分之一天平（精密度为0.1 mg）德国Sartorius公司；Milli-Q Gradient超纯水仪美国Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流速：0.5 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5μL；流动相：A为水溶液（含0.1%甲酸），B为甲醇；流动相梯度洗脱程序：0～1.5 min，5% B；1.5～5.0 min，5%～60% B；5.0～10.0 min，60%～95% B；10.0～15.0 min，95% B；15.0～18.0 min，95%～5% B；18.0～30.0 min，5% B。

1.4.2 质谱条件

电喷雾电离源ESI⁺的检测方式：多反应监测模式（MRM）；气帘气（CUR）：35 psi；碰撞气（CAD）：中；离子化电压（IS）：5 500 V；离子源温度：550 ℃；喷雾气（GS1）：55 psi；辅助加热气（GS2）：60 psi。

电喷雾电离源ESI^－的检测方式：多反应监测模式（MRM）；气帘气（CUR）：35 psi；碰撞气（CAD）：中；离子化电压（IS）：－4 500 V；离子源温度：550 ℃；喷雾气（GS1）：55 psi；辅助加热气（GS2）：60 psi。

1.4.3 溶液的配制

有机酸标准储备液（1 000μg/mL）的配制：分别准确称取单个有机酸标准品10 mg（精确至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并用甲醇定容，混匀后于4 ℃保存。

有机酸混合标准工作液（10μg/mL）的配制：准确移取100μL有机酸标准储备液于10 mL容量瓶中，用50%甲醇-水溶液定容，作为混合标准工作液。取混合标准工作液适量，依次配成系列浓度的混合标准溶液，现用现配。

氨基酸混合标准工作液的配制：准确移取100μL氨基酸标准储备液于10 mL容量瓶中，用水定容，作为一级混合标准工作液（10μg/mL）。准确移取1 000μL一级氨基酸标准储备液于10 mL容量瓶中，用水定容，作为二级混合标准工作液（1μg/mL）。取混合标准工作液适量，依次配成系列浓度的混合标准溶液，现用现配。

1.4.4 样品前处理

称取粉碎试样2.0 g（精确至0.000 1 g）置于50 mL离心管中，加入30 mL超纯水，充分匀浆1 min，40 ℃超声提取30 min，以8 000 r/min离心5 min，移取上清液至100 mL容量瓶中，重复提取1次，合并提取液，用水定容后过0.22μm滤膜，待测。

1.4.5 方法学考察

1.4.5.1 线性关系、相关系数和检出限

以对照品浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到15种有机酸和18种氨基酸的线性方程和相关系数。以信噪比（S/N）约为3计算各成分的检出限（LOD），以信噪比（S/N）约为10计算各成分的定量限（LOQ）。

1.4.5.2 精密度和加标回收率实验

精密称取紫洋葱-1试样18份，每份2.0 g，分别加入3.75，6.25，12.5 mg/kg的标准溶液，上机分析测试后计算添加水平的加标回收率和相对标准偏差（n=6）。

2 结果与分析

2.1 MRM模式下15种有机酸和18种氨基酸检测方法的建立

在国家标准和文献[17-19]的基础上，优化了33种待测物质的碰撞能量（CE）和去簇电压（DP），最终得到的15种有机酸和18种氨基酸的质谱条件见表1。

2.2 色谱条件的优化

目标物的峰形、分离度与色谱柱的使用息息相关，本实验考察了ACQUITY UPLC BEH Amide、ACQUITY UPLC^?BEH C₁₈、ACQUITY UPLC^?T3、ACQUITY UPLC HILIC-Z、ACQUITY UPLC C₁₈5种色谱柱的出峰及峰型情况。使用色谱柱ACQUITY UPLC BEH Amide、ACQUITY UPLC HILIC-Z色谱柱进行分析时，氨基酸出峰较好，有机酸出峰差；使用ACQUITY UPLC^?BEH C₁₈、ACQUITY UPLC^?T3、ACQUITY UPLC C₁₈色谱柱时，目标物均在10 min内出峰且峰形较好，但是3种规格的色谱柱中ACQUITY UPLC^?T3和ACQUITY UPLC C₁₈色谱柱分离目标化合物时分离度较低。因此，在后续的实验中采用ACQUITY UPLC^?BEH C₁₈色谱柱进行实验分析。

目标化合物中的有机酸为弱酸，流动相体系在弱酸的条件下可以防止有机酸解离^[20]。同时，在流动相中加入少量甲酸提供酸性环境，可促进目标化合物的电离，提高质谱响应。因此，选择0.1%甲酸-水溶液+甲醇作为流动相时各化合物的峰型较好，在该条件下15种有机酸和18种氨基酸的MRM图见图1。

2.3 提取溶剂的优化

分别考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水5种溶剂对33种目标化合物的提取效率的影响，结果见图2。

由图2可知，氨基酸和有机酸难溶于有机溶剂，以甲醇作为提取溶剂时，目标化合物的回收率低；以50%甲醇作为提取溶剂时，有机酸的回收率较高，但是氨基酸的回收率较低；样品中含有蛋白质、糖和脂肪等，基质较复杂，使用乙醇和50%乙醇作为提取溶剂时，样品中的脂肪等易溶于乙醇，干扰较严重；氨基酸和有机酸易溶于水，以水作为提取溶剂时对目标化合物的提取效果较好。因此，在后续实验中选择水作为提取溶剂。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、相关系数和检出限

15种有机酸和18种氨基酸的线性关系见表2。

由表2可知，15种有机酸和18种氨基酸在各自的线性范围内具有良好的线性关系，相关系数（r）≥0.995 17，检出限在0.000 7～3.989 4 mg/kg范围内，定量限在0.002 2～13.297 9 mg/kg范围内。

2.4.2 回收率和精密度

加标回收率和精密度结果见表3。

由表3可知，15种有机酸和18种氨基酸的加标回收率范围为59.2%～122.9%，相对标准偏差范围为0.61%～5.26%，表明本方法的准确性良好。

2.5 样品测定

3种不同类型洋葱样品中有机酸和氨基酸的含量见表4。

由表4可知，3种类型洋葱中共检出6种有机酸和18种氨基酸，其中必需氨基酸6种，条件必需氨基酸2种，非必需氨基酸10种。

6批次洋葱样品中有机酸总量在392.05～669.03 mg/kg之间，平均含量为561.54 mg/kg。有机酸中富马酸的含量最高，含量在387.43～661.00 mg/kg之间，平均含量为552.28 mg/kg，占有机酸总量的98%。从3种类型洋葱样品中有机酸含量的对比分析可以看出，黄洋葱中有机酸含量高于紫洋葱和白洋葱，白洋葱中有机酸含量最低。

6批次洋葱样品中氨基酸总量在6 038.54～8 113.38 mg/kg之间，平均含量为6 927.31 mg/kg。18种氨基酸中L-赖氨酸含量最高，含量在2 238.33～3 298.27 mg/kg之间，平均含量为2 731.15 mg/kg，占氨基酸总量的39.43%。其次为L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-天冬酰胺，分别占氨基酸总量的20.22%、14.84%、5.68%。洋葱样品中检测出6种人体必需氨基酸，必需氨基酸总量在2 714.90～3 812.13 mg/kg之间，平均含量为3 202.04 mg/kg，占氨基酸总量的46.18%。6批洋葱样品中必需氨基酸总量占氨基酸总量（EAA/TAA）的42.45%～47.34%。从3种类型洋葱样品中氨基酸含量对比分析可以看出，紫洋葱中氨基酸总量和必需氨基酸总量高于黄洋葱和白洋葱。

3 结论

本文采用UPLC-MS/MS建立了快速测定洋葱中15种有机酸和18种氨基酸的检测方法。33种目标化合物在各自的线性范围内线性关系良好，检出限范围为0.000 7～3.989 4 mg/kg，定量限范围为0.002 2～13.297 9 mg/kg；加标回收率为59.2%～122.9%，RSD范围为0.61%～5.26%。采用建立的方法对3种不同类型的洋葱中有机酸和氨基酸含量进行了测定。结果显示，3种类型洋葱中共检出6种有机酸和18种氨基酸，其中必需氨基酸6种，条件必需氨基酸2种，非必需氨基酸10种；6批次洋葱样品中有机酸总量在392.05～669.03 mg/kg之间，平均含量为561.54 mg/kg，其中富马酸的含量最高，占有机酸总量的98%，黄洋葱中有机酸含量高于紫洋葱和白洋葱；6批次洋葱样品中氨基酸总量在6 038.54～8 113.38 mg/kg之间，平均含量为6 927.31 mg/kg，其中L-赖氨酸含量最高，占氨基酸总量的39.43%；洋葱样品中检测出6种人体必需氨基酸，平均含量为3 202.04 mg/kg，占氨基酸总量的46.18%，紫洋葱中必需氨基酸总量和氨基酸总量高于黄洋葱和白洋葱。本研究建立的方法灵敏度高、操作简便，可以广泛应用于洋葱中有机酸和氨基酸含量的测定，测定的数据可为洋葱的精深加工提供一定的理论依据。

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