太子参及提取物对动物免疫调节作用研究进展

2024-06-12豆晓霞刘晓东付本懂

动物医学进展 2024年5期

张森,欧婧,豆晓霞,刘晓东,付本懂

(1.黔东南民族职业技术学院,贵州凯里 556000;2.吉林大学动物医学学院,吉林长春 130062)

随着我国畜牧业的快速发展,国际引种、畜禽贸易日益频繁,导致动物疫病呈现多样化、复杂化、严重化的态势,严重阻碍了我国畜牧业的发展。随着国家“减抗”和“限抗”等政策的出台和实施,畜禽疫病防控面临更大的压力。中兽药防治畜禽疾病在我国具有悠久的历史,近年来中兽药以其无残留、不易耐药、安全范围广、资源丰富等特点受到广泛关注。

太子参是石竹科植物孩儿参(Pseudostellariaheterophylla)干燥的块根,始记载于清代《本草从新》,收载于中国药典,其药性平和,有生津润肺、益气健脾等增强体质之功效。现代药理研究,太子参富含微量元素、氨基酸、糖类、苷类、环肽类、脂肪酸类、油脂类、挥发油类、甾醇类等多种活性成分[1],张炎达等[2]对太子参研究数据进行Meta分析表明,太子参及提取物可显著提升动物机体免疫力。黄宗锈等[3]给妊娠的SD大鼠长期灌服大剂量的太子参提取浓缩液,发现其对孕鼠生殖能力、胚胎形成和胎鼠的生长发育均无影响,表明太子参毒副作用小,安全范围广,具有较好的开发利用前景。本文综述了近年来太子参及其提取物对动物免疫调节的相关研究,为太子参的进一步研究、开发和利用提供参考。

1 对免疫器官的作用

免疫器官分为中枢免疫器官和外周免疫器官,是免疫细胞产生、分化、成熟、定居和产生免疫应答的场所。胸腺/法氏囊(禽类)是T细胞发育、分化、成熟的场所,随着动物年龄的增长逐渐萎缩退化[4]。脾脏是机体最大的外周免疫器官,是免疫细胞定居的器官,含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞,可清除体内的病原体、衰亡的体细胞以及免疫复合物等[5]。胸腺和脾脏分别是动物中枢免疫器官和外周免疫器官的代表,其组织结构的完整性代表着动物免疫机能是否健全。胸腺和脾脏指数被认为是免疫功能的重要评价指标[6]。蔡晶等[7]给小鼠灌服太子参多糖粗提物显示,高剂量组和中剂量组胸腺指数显著升高,低剂量组和高剂量组脾脏指数显著升高。张炎达等[8]的研究结果也显示,太子参须提取物能提高小鼠脾指数和胸腺指数,但不同剂量对脾脏和胸腺的影响不同。郝思钰[9]给雏鸡注射太子参多糖注射剂,发现雏鸡脾脏指数和法氏囊指数显著提高,其中以低剂量效果作为显著,说明太子参多糖能促进雏鸡免疫器官的发育,并且和剂量有一定的关系。

太子参及其提取物除了能促进健康动物免疫器官的发育,研究表明其还能保护或减少有害物质对免疫器官的损害,缓解动物免疫抑制或免疫功能低下。衣伟萌等[10]研究显示,给环磷酰胺免疫抑制小鼠灌服太子参参须多糖,能显著的改善由于环磷酰胺所致的胸腺、脾脏以及肝萎缩,高剂量组小鼠的脾脏指数和肝指数极显著升高,胸腺指数也有提升的趋势。冯丹等[11]给环磷酰胺免疫抑制小鼠灌服太子参多糖,实验结果与衣伟萌基本相同。然而,闵思明等[12]试验结果显示太子参参须多糖显著降低环磷酰胺免疫抑制小鼠脾脏指数,这与其他人的研究结果截然不同。闵思明试验中病模型组小鼠的脾脏过度肿大,脾脏指数几乎是空白对照的2.5倍。因此推测可能是造模过程中,环磷酰胺对小鼠脾脏损造成过度损伤,脾脏过度炎症和组织增生,太子参参须多糖修复了脾脏损伤,让其向正常水平恢复。后续的脾脏淋巴增殖实验和腹腔巨噬细胞吞噬试验也证实了太子参参须多糖的免疫器官保护作用。付杨等[13]给SD大鼠注射利血平造成脾虚模型,灌服太子参参须多糖后,脾脏指数和胸腺指数相对模型组均有显著提高。此外,宋玉龙等[14]将太子参多糖进行硒化修饰,然后将太子参多糖和硒化太子参多糖分别皮下注射环磷酰胺免疫抑制小鼠,结果显示太子参多糖和硒化太子参多糖均能显著提高脾指数和胸腺指数,其中硒化太子参多糖的作用优于太子参多糖。

2 对免疫细胞的作用

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞,是机体免疫系统重要的组成部分,主要包括巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、粒细胞、肥大细胞等。太子参及提取物能有效促进机体免疫细胞增殖,增强免疫活性。

2.1 巨噬细胞

巨噬细胞是固有免疫系统中重要的免疫细胞之一,通过吞噬作用、分泌炎性介质和细胞因子杀伤病原体,如NO、ROS、TNF-α和IL-1等,在免疫防御中发挥着重要的作用[15]。蔡晶等[7]报道太子参多糖粗提物能提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。张炎达等[8]报道了太子参须提取物可显著提高健康昆明小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数α值。

RAW264.7细胞是巨噬细胞/单核样细胞系,易于增殖,DNA转染效率高、对RNA干扰敏感[16],常用于研究免疫过程中巨噬细胞的分子机制[17]。陈小英等[18]研究发现太子参须多糖粗提物能显著提高RAW264.7细胞的相对增殖率,促进巨噬细胞对中性红和隐球菌的吞噬能力;张丽娟等[19]给RAW264.7细胞添加不同浓度的太子参多糖,结果显示NO和TNF-α的释放显著增加。吴秀钦等[20]将太子参多糖进行硒化,用Griess法测定太子参多糖及其硒化太子参多糖对RAW264.7细胞的影响,结果显示太子参多糖和硒化太子参多糖在一定浓度促进巨噬细胞对中性红吞噬能力,促进NO的产量以及IL-6、TNF-α的分泌,并且硒化太子参多糖作用优于太子参多糖。

此外,太子参及提取物能提高免疫损伤动物巨噬细胞的吞噬活性和保护巨噬细胞成活,进而改善免疫抑制或免疫损伤。吴秀钦等[21]通过小鼠碳粒廓清试验发现,硒化太子参多糖能提高环磷酰胺免疫损伤小鼠巨噬细胞的吞噬能力,降低环磷酰胺对免疫器官的损伤,降低由环磷酰胺造成免疫损伤小鼠IL-6、TNF-α分泌量减少的影响,并且硒化太子参多糖效果优于太子参多糖。衣伟萌等[10]也报道了太子参参须提取物能提高环磷酰胺免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性,其中低、高剂量组的碳粒廓清指数K和吞噬指数α显著升高。谢美林等[22]研究发现,太子参多糖在一定浓度范围可以提高LPS诱导损伤下RAW264.7巨噬细胞的存活率,改善细胞形态。

除了太子参多糖,曾丽等[23]研究发现太子参参须皂苷(RPFRS)也能增强RAW264.7细胞的吞噬活性,在一定浓度下能提高NO、IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α分泌量。进一步研究发现,太子参参须皂苷能够上调TLR2、MyD88、TRIF与胞核NF-κB蛋白,下调TLR4、IκB-α蛋白的相对表达量。推测RPFRS可能是通过 TLR2/4MyD88/TRIF-NF-κB信号通路活化RAW264.7细胞,增强其增殖能力、吞噬活性,以及产生NO和分泌细胞因子的能力。

此外,Yang Q等[24]通过酶水解和凝胶过滤层析技术在太子参中获得一种水解产物-太子参肽(PPH),分子质量在1 ku以下。将其作用于RAW264.7细胞,发现PPH在100 μg/mL浓度对RAW264.7细胞没有任何的毒性,与对照组相比,PPH能显著促进RAW264.7细胞产生NO,并伴随着iNOS mRNA的上调表达,证实PPH促进RAW264.7产生NO是通过iNOS催化产生的。此外,PPH能增强RAW264.7细胞的吞噬活性,刺激RAW264.7细胞产生ROS,促进RAW264.7细胞产生IL-10和TNF-α,并且在体内能促进环磷酰胺免疫抑制小鼠T淋巴细胞增殖,增强NK细胞活性,能显著促进小鼠腹膜巨噬细胞吞饮活性和NO的产量。说明该太子参肽具有增强巨噬细胞活性的作用,提高免疫抑制小鼠的固有免疫应答。

Yang Q等[25]采用RP-HPLC技术进一步从PPH中纯化到一种特殊肽(RP-5),氨基酸序列为Arg-Gly-Pro-Pro-Pro,分子质量为522.29 u。将RP-5与RAW264.7细胞作用后发现,RP-5能显著提升RAW264.7细胞吞饮率,相比对照组达到123.81%,提高了ROS产量,显著提升了TNF-α的分泌,分泌量能达到827.24 pg/mL。但对IL-10的分泌没有影响。通过RT-PCR技术、基因敲除技术和Western blot技术研究进一步发现,RP-5是通过与RAW264.7细胞表面表达的TLR2结合,激活了NF-κB信号通路,进而调节巨噬细胞免疫功能。

2.2 NK细胞

NK细胞是固有免疫系统中的另一重要免疫细胞,在抗病毒感染和抗肿瘤方面起着重要的作用。NK细胞能通过ADCC作用清除感染细胞,通过分泌促炎因子,活化吞噬细胞。研究发现荔枝多糖[26]、人参多糖[27]、杏鲍菇多糖[28]、白术多糖[29]等均具有提高NK细胞杀伤活性作用。乔石等[30]研究发现环磷酰胺显著减低小鼠脾NK细胞杀伤力,但太子参参须多糖可显著提高免疫抑制小鼠脾NK细胞对YAC-1肿瘤细胞的杀伤作用,并且在100mg/kg剂量时,效果最强。曾丽等[31]观察到太子参参须皂苷对NK细胞的杀伤能力有明显的提升作用。

2.3 T、B细胞

T、B淋巴细胞在机体细胞免疫中具有十分重要的作用,T淋巴细胞及辅助T淋巴细胞(Th)可以刺激B淋巴细胞的生长和分化,同时还可以分泌细胞因子激活巨噬细胞参与细胞介导的免疫应答,B淋巴细胞则主要是产生抗体,在体液免疫中发挥作用。太子参及其提取物具有促进T、B淋巴细胞增殖、分化、产生免疫分子的作用,从而提高机体的细胞免疫和体液免疫。张炎达等[8]给健康小鼠灌服不同剂量的太子参参须提取物发现,中剂量组小鼠T淋巴细胞刺激指数显著升高,各剂量对小鼠B淋巴细胞刺激指数有一定的升高作用,但无显著性差异。说明太子参参须提取物对小鼠的T、B淋巴细胞有一定的正向作用,其中对T淋巴细胞的影响更为显著。Yang等[32]将不同剂量的太子参肽(PPH)作用于小鼠脾淋巴细胞发现,PPH能促进脾淋巴细胞增殖,诱导Th细胞产生,并分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10,说明PPH促进了T淋巴细胞转化,而非B淋巴细胞。并且PPH能提升细胞内Ca2+浓度、钙调磷酸酶活性和T细胞活化核因子(NFAT)c1 mRNA的表达,这效应能被维拉帕米和环孢素A阻断,证明PPH活化脾脏淋巴细胞是通过Ca2+/CaN/NFATc1/IFN-γ信号通路。Yang等[25]进一步从PPH中分离纯化到仅有5个氨基酸肽的肽链(RP-5)作用于小鼠脾脏细胞发现,RP-5在100 μg/mL时能协同ConA显著提升脾淋巴细胞增殖分化为T细胞,但各浓度对LPS刺激脾淋巴细胞增殖分化为B淋巴细胞没有明显的作用。曾丽等[33]将太子参参须多糖与OVA注射小鼠,发现太子参参须多糖能够显著提高T细胞的SI值,而对B细胞的SI值影响不显著。曾丽等[31]将太子参参须皂苷与OVA注射小鼠,发现太子参参须皂苷各剂量组对T细胞的SI均有显著提高,但只有低剂量组能显著提升B细胞SI。由此可见,太子参及提取物虽然能促进脾淋巴细胞增殖分化为T、B淋巴细胞,但是更偏向于T淋巴细胞。然而,乔石[34]研究显示,当浓度在12.5～400 μg/mL时,太子参参须多糖协同ConA可显著促进T淋巴增殖,当浓度在50～400 μg/mL时,协同LPS可显著促进B淋巴细胞的增殖。显示太子参参须多糖在T、B淋巴细胞增殖上与剂量有密切的关系。

T细胞亚群的数量和比值是评估机体免疫平衡最有价值的参数,细胞免疫状态的评价指标有CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群含量和CD4+/CD8+比值,CD4+/CD8+比值升高表明免疫反应上调,反之则表明免疫反应降低[35]。曾丽等[33]给小鼠注射太子参参须多糖加OVA后,采用流式细胞术检测发现,太子参参须多糖能提高小鼠脾细胞中的CD3+、CD4+T细胞数量,降低CD8+T细胞数量。上调CD4+/CD8+T细胞比值,增强T细胞免疫应答。曾丽等[31]将太子参参须皂苷加OVA注射小鼠后发现,太子参参须皂苷组的CD3+、CD4+、CD8+T细胞数均显著提升,CD4+/CD8+比值显著升高。说明太子参及提取物具有平衡机体,增强T细胞免疫,提高免疫应答的作用。

环磷酰胺能造成小鼠免疫抑制,CD3+、CD4+T细胞亚群含量和CD4+/CD8+比值明显低于正常小鼠[36]。乔石等[30]研究显示太子参参须多糖可显著提高环磷酰胺免疫损伤小鼠脾脏中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+比值,显著降低因环磷酰胺所致的小鼠脾淋巴细胞的凋亡,高剂量组的CD4+/CD8+比值显著升高,基本接近于正常小鼠。

T-bet是T-box新型转录因子,经IFN-γ诱导表达于Th1细胞和巨噬细胞,通过激活Th1遗传程序和抑制Th2程序来启动Th1细胞表达,介导细胞免疫。GATA-3是Th2细胞的特异性表达因子,能够改变Th1细胞表型,促进Th2细胞表达,介导体液免疫。T-bet/GATA-3比值对维持Th1/Th2免疫反应的动态平衡发挥着重要作用[37-38]。乔石[30]研究显示,环磷酰胺可显著降低小鼠脾淋巴细胞T-bet/GATA-3比值,而太子参参须多糖可显著提高免疫损伤小鼠T-bet mRNA 的转录水平、降低GATA-3 mRNA的转录水平,当太子参参须多糖剂量为200 mg/kg时,小鼠脾淋巴细胞T-bet/GATA-3的比值接近于正常小鼠,Th1/Th2的比值恢复到相对平衡状态,说明太子参参须多糖可以通过调节免疫抑制小鼠脾细胞转录因子mRNA的转录水平来调节相关转录因子的分泌,从而促使免疫抑制小鼠的细胞免疫水平向正常状态恢复。

3 对免疫分子的作用

3.1 对细胞因子的作用

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白,一般通过结合相应受体调控免疫应答。太子参及其提取物可以影响细胞因子的表达和分泌,从而调节动物免疫功能。乔石等[30]研究显示,太子参参须多糖在200～400 mg/kg剂量时,能显著提高环磷酰胺免疫抑制小鼠脾淋巴细胞IL-2、IFN-γ mRNA转录水平,同时抑制IL-4、IL-6 mRNA转录水平的升高。严胜泽等[39]研究发现太子参多糖能显著提升环磷酰胺免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-6、IFN-γ含量。付杨等[13]用太子参参须和太子参参须多糖治疗利血平所致的SD大鼠脾虚模型,结果与严胜泽报道一致。曾丽等[31,33]将太子参参须多糖和皂苷分别与鸡卵白蛋白(OVA)联合免疫小鼠,与OVA组相比,药物组除了能提高小鼠特异性抗OVA抗体水平外,还能显著提升IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ mRNA转录水平及血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的含量,说明太子参参须多糖和皂苷对小鼠的细胞免疫和体液免疫都有一定的促进作用。陈小英等[18]发现太子参须多糖能恢复隐球菌感染小鼠的体质量,增加IL-10、IL-1β及TNF-α的分泌,降低IL-6的分泌,减少感染小鼠肺部和脑部的隐球菌数量,并增强肺部TLR4受体、CREB和p-CREB的表达。因此,推测太子参须多糖能增强感染小鼠肺部免疫细胞TLR4表达,TLR4活化后,进一步激活cAMP反应元件结合蛋白(CREB),进而促进白介素IL-10和TNF-α的合成。

由此可见,太子参及其提取物能调节细胞因子的分泌,进而发挥免疫调节的作用,但是其对细胞因子的调节比较复杂,各报道的情况也不尽相同。

3.2 对抗体分子的作用

抗体是B细胞受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白,主要存在于血清等体液中,是介导体液免疫的重要效应分子,能与相应抗原特异性结合,发挥免疫功能,主要有IgA、IgG、IgM、IgD和IgE五大类,分别发挥不同的免疫功能。曾丽等[33]用太子参参须多糖与OVA同时免疫小鼠,结果显示太子参参须多糖能显著提高OVA-IgG、OVA-IgG2a、OVA-IgG2b抗体水平,OVA-IgG1抗体水平有所提高,但差异不显著。曾丽等[31]又将太子参参须皂苷与OVA共同免疫小鼠,发现太子参参须皂苷能显著提高小鼠血清中OVA-IgG、OVA-IgG1、OVA-IgG2a、OVA-IgG2b的含量。说明太子参多糖和太子参皂苷都能增强OVA免疫原性,提高小鼠机体对OVA的免疫应答,促进抗体分泌,提高机体的体液免疫应答,加之太子参多糖及皂苷也能促进免疫细胞分泌细胞因子,提高细胞免疫应答,因此太子参多糖和皂苷具有良好的开发为疫苗佐剂的潜力。

此外,太子参提取物还具有缓解免疫抑制,提高免疫损伤动物抗体水平的作用。衣伟萌等[10]发现太子参参须提取物能显著提高环磷酰胺免疫抑制小鼠血清中IgA、IgM和IgG抗体分子含量,高剂量组 IgA、IgM 及 IgG 水平甚至高于黄芪多糖阳性对照组。甘思言[40]报道了太子参参须提取物能提高小鼠血清中IgA、IgG、IgM含量,不同剂量的太子参提取物对不同类型的抗体分子影响不同,与衣伟萌的研究结果基本一致。付杨等[13]研究显示太子参须散和太子参参须多糖能显著提高利血平所致的脾虚SD大鼠血清抗体水平,其中太子参须散组IgM显著升高,IgA、IgG水平极显著升高;太子参多糖组IgA、IgM水平均显著升高,IgG水平极显著升高。说明太子参及提取物不但能增强抗原原性,增强体液免疫,同时也能解除免疫抑制,提高机体抗体水平,增加保护力。

3.3 对补体分子的作用

补体是一种血清蛋白质,存在于动物血清及组织液中,活化后具有酶活性、可介导免疫应答和炎症反应。补体C3和C4在血清中的含量高于其他补体分子,二者在完成补体系统的多种功能中具有十分重要的作用。杜蓥蓥等[41]给小鼠灌服太子参参须提取物,发现中剂量组补体C3含量显著升高。衣伟萌等[10]研究显示太子参参须提取物能极显著升高环磷酰胺所致的小鼠血清C3和C4含量降低。甘思言等[40]等也有类似的试验结果。说明太子参提取物能提高小鼠血清中C3和C4的含量,但其相关机制研究以及对其他动物补体分子的作用尚未见报道。

4 对肠道黏膜免疫的作用

肠道黏膜不仅仅是消化和吸收营养物质的器官,同时也是重要的免疫屏障,细胞因子和SIgA抗体分子在肠道黏膜免疫中起着重要的作用[42],构筑了防止病原菌在肠道黏膜中定植的第一道防线。严胜泽等[39]研究表明,太子参多糖能使环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠各肠段肠道绒毛长度增加,V/C比值升高,肠黏膜上皮内淋巴细胞数和杯状细胞数增多,并且十二指肠和回肠中SIgA、IL-2、IL-6含量显著升高。You S Y等[43]研究显示,太子参多糖能提高DSS所致的结肠炎小鼠结肠长度,降低IL-1β和TNF-α炎性因子水平,肠道黏膜上皮更完整,杯状细胞更多,淋巴细胞和中性粒细胞浸润降低,TLR4表达升高。进一步通过16S序列和OTUs聚类分析,显示拟杆菌和假单胞菌成为优势肠道菌。说明太子参多糖具有修复保护肠道黏膜结构、促进SIgA和细胞因子分泌的作用,并通过TLR4信号通路抑制炎性因子产生,平衡肠道菌落群等机制改善肠道炎症和调节肠道黏膜免疫功能。